Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий

Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий

Автор: Кульбачинский, Андрей Владимирович

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 251 с. ил.

Артикул: 4566511

Автор: Кульбачинский, Андрей Владимирович

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
I. СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНКП
МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ И КАТАЛИЗА
1. Общий механизм инициации транскрипции.
2. Структура бактериальной РНКП.
2.1. Структура корфсрмснта РНКП
2.2. Структура холофермента РКП.
2.3. Структура стсубъединицы РНКП
3. Структурные модели промоторного и элонгационного комплексов
3.1. Структурная модель промоторного комплекса
3.2. Структурные перестройки промоторного комплекса в ходе инициации транскрипции.
3.3. Миксопиронии антибиотик, блокирующий образование открытого промоторного комплекса.
3.4. Структура элонгационного комплекса.
4. Механизм синтеза РНК в активном центре РНКП
4.1. Реакции, катализируемые РНКП.
4.2. Механизм синтеза РНК присоединение ЫТР в активном центре
и функция Спетли
4.3. Механизм транслокации РНКП и функция Бснирали.
4.4. Антибиотики, блокирующие каталитический цикл РНКП
4.4.1. Стрептолидигин блокирование образования инсерционного комплекса.
4.4.2. Аманитин блокирование транслокации РНКП.
5. Регуляция транскрипции факторами, действующими
на активный центр РНКП.
5.1. Факторы, регулирующие расщепление РНК в активном центре
5.1.1. Стимуляция расщепления РНК Сгефакторамн.
5.1.2. Регуляция транскрипции белками САП и Клк.
5.2. Регуляция транскрипции ррврр и Бк5А
5.2.1. Функции ррСрр в регуляции инициации транскрипции.
5.2.2. Функции белка ОкзА стимуляция связывания ррОрр.
5.3. Антибиотики, нарушающие связывание ионов Мц2 в активном центре РНКП
5.3.1. Тагетитоксин связывание дополнительного иона М2н
в активном центре РНКП
5.3.2. Рифампицин нарушение связывания каталитических ионов 2.
5.3.3. Сорангицин функциональный аналог рифампищша
5.4. Заключение.
II. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АПТАМЕРОВ К БЕЛКАМ.
6. Аптамеры и области их применения.
7. Методы отбора аптамеров
7.1. Общая схема отбора.
7.2. Библиотеки, используемые для отбора
7.3. Использование модифицированных нуклеотидов.
7.4. Сайтнаправленный отбор аптамеров
7.5. Регулируемые и сигнальные аптамеры. Аптазимы.
8. Характеристики аптамеров
8.1. Структурные особенности аптамеров.
8.2. Аффинность и специфичность
8.3. Эпитопы, узнаваемые аптамерами
8.4. Трехмерная структура аптамербелковых комплексов
8.5. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Бактериальные штаммы, плазмиды.
2. Стандартные методы работы с ДНК.
3. Получение промоторных фрагментов ДНК
3.1. Получение матриц для транскрипции.
3.2. Получение радиоактивномеченых промоторных фрагментов.
4. Получение радиоактивномеченых олигонуклеотидов
5. Конструирование мутаций в субъединицах РНКП.
5.1. Р и Рсубъединицы РНКП
5.2. стсубъединицы .i и Т. i.
6. Электрофорез белков в денатурирующем геле.
7. Выделение сгсубъединицы РНКП.
8. Выделение корфермента РНКП.
9. Реконструкция РНКполимеразы i vi.
. Получение ковалентных сшивок РНКП с ДНК.
. Картирование сайтов ДНКоелковых сшивок.
. Получение аптамеров к РНКП
.1. Аптамеры к корферменту Е. i.
.2. Аптамеры к корферменту Т. i
.3. Аптамеры к стсубъединице РНКП
.4. Аптамеры к холоферменту РНКП
. Измерение связывания олигонуклеотидов с РНКП
. ТРАНСКРИШ1ИЯ I VI.
. Ковалентные сшивки РНКП с 5инициаторным .
. Эксперименты с минимальной матрицей.
. Футпринтинг перманганатом калия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Получение аптамеров к РНКП
1.1. Общий метод получения аптамеров.
1.2. Аптамеры к корферменту РНКП
1.2.1. Общая характеристика аптамеров.
1.2.2. Районы корфермента РНКП, участвующие в связывании аптамеров.
1.2.3. Влияние различных лигандов РНКП на связывание аптамеров
1.2.4. Специфическое узнавание ДНК корферментом РНКП.
1.3. Аптамеры к стсубъединице и холоферменту РНКП.
2. Механизмы узнавания промоторных элементов РНКП.
2.1. Общий механизм узнавания промоторов.
2.2. Стимуляция ДНКсвязывающей активности стсубъединицы
корферментом РНКП.
2.3. Узнавание промоторных элементов свободной стсубъединицей РНКП.
2.3.1. Узнавание элемента промотора стсубъединицей РНКП
2.3.2. Узнавание элемеита
2.3.3. Узнавание элемента
2.4. Ингибирование связывания ДИК в свободной сгсубъединице
3. Роль элемента в узнавании промоторов РНКП.
3.1. Синтетические промоторы на основе аптамеров
3.2. в природных промоторах Т. i и Т. i.
3.3. Узнавание элемента РНКП . i.
3.4. Структурные элементы РНКП, необходимые для узнавания содержащих промоторов
4. Механизм образования открытого промогорного комплекса РНКП.
4.1. Узнавание шпилечных матриц холоферментом РНКП
4.2. Механизм открывания промотора РНКП мезофильных
и термофильных бактерий.
4.2.1. Открывание промоторов РНКГ1 мезофильных и термофильных бактерий
4.2.2. Структурные элементы стсубъединицы IПСП, участвующие в плавлении промоторов
4.3. Различия в структуре контактов РНКГ1Е i и Т. i с промотором
4.4. Механизмы стабилизации промоторного комплекса
4.4.1. Роль элемента в стабилизации промоторных комплексов.
4.4.2. Роль контактов корфермента I с ДНК спереди по ходу транскрипции
в стабилизации промоторных комплексов.
4.4.3. Различия в стабильности промоторных комплексов РНКП . i,
Т. i и . i.
5. Механизм инициации синтеза РНК.
5.1. Роль асубъединицы в инициации синтеза РНК.
5.2. Роль района vi2 субъединицы в инициации синтеза РНК
6. Механизм ухода РНКП с промотора
6.1. Роль асубъединицы в уходе РНКП с промотора
6.2. Стабильность промоторных комплексов и эффективность
перехода к элонгации
7. Сравнение структуры активного центра РНКП мезофильных
и термофильных бактерий.
7.1. Различия в скорости синтеза РНК у мезофилов и термофилов.
7.2. Структурные элементы РНКП, определяющие скорость синтеза РНК.
8. Заключение. Общий механизм инициации транскрипции
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Характерной чертой промоторов, с которыми РНКП образует нестабильные комплексы, является наличие какихлибо отличий от канонической структуры несоответствие последовательностей и элементов консенсусу, неоптимальная длина спенсера между ними и наличие дискриминатора в районе между элементом и стартовой точкой транскрипции . Вероятно, отличия от консенсусной структуры обеспечивают более тонкую регуляцию транскрипции на данных промоторах. Как уже было сказано выше, трехмерная структура промежуточных комплексов, формирующихся в ходе образования открытого промоторного комплекса при переходе к элонгации транскрипции, остается неизвестной. Однако, анализ структуры РНКП, моделей открытого промоторного комплекса и элонгационного комплекса, а также имеющиеся биохимические данные в частности, данные футпринтинга промежуточных промоторных комплексов различными нуклеазами и химическими агентами i . Рис. Рис. Модель структурных перестроек РНКП на разных стадиях инициации транскрипции из . А Закрытый промоторный комплекс. Корфермент РНКП изображен голубым, осубъединица бежевым цветом. Показано расположение консервативных районов асубъединицы и участков промотора, обозначен ион в активном центре, вторичный канал и некоторые из структурных элементов корфермента РНКП. Отрицательно заряженные остатки в районах 1. Б Промежуточный промоторный комплекс. В Открытый промоторный комплекс. Показано расположение матричной и нематричной цепей ДНК. Г Инициаторный комплекс Iii ii x. РНК обозначена красным, прямой стрелкой указан путь, по которому нуклеотиды попадают в активный центр РНКП. Показаны участки ДНК, вытесненные из главного канала в результате начала транскрипции. Изогнутыми стрелками показано перемещение районов 1. В закрытом промоторном комплексе ДНК взаимодействует с РНКП в участке от до 5 позиций относительно стартовой точки транскрипции, причем одна из сторон двунитевой молекулы ДНК не взаимодействует с РНКП и доступна действию нуклеаз. Район 1. РНКП Рис. А. Образование промежуточного промоторного комплекса сопровождается существенными конформационными перестройками РНКП. ДНК остается в двухцепочечном состоянии, однако, футпринт РНКГ1 расширяется примерно до позиции промотора. Вероятно, при образовании передний дуплекс ДНК входит в главный канал РНКП, при этом район 1. Рис. Б . При образовании открытого комплекса происходит плавление ДНК, которое инициируется в области элемента, повидимому, в результате взаимодействия ароматических аминокислотных остатков в районе 2. Плавление распространяется в область стартовой точки транскрипции, при этом нематричная цепь ДНК в области элемента образует сиквенсспецифические контакты с асубъединицей, а матричная цепь направляется в активный центр фермента и оказывается замкнута в канале между сусубъединицей и корферментом РНКП. Передний дуплекс ДНК поворачивается примерно на и помещается между доменами и субъединицы Рис. Моделирование структуры инициаторного комплекса i показывает, что синтезируемый в ходе инициации РНКтранскриит должен располагаться в том же участке главного канала, в котором располагается район 3. РНКП Рис. Г. Это позволяет предположить, что при удлинении РНК происходит вытеснение этого района из главного канала РНКП. Кроме того, по мере удлинения РНК передний дуплекс ДНК поступает внутрь фермента, а транскрибированная часть ДНК выиетливается из главного канала I1 т. Все это приводит к увеличению напряженности в транскрипционном комплексе. Результатом этого может являться либо диссоциация РНК, либо дальнейшее удлинение РНК и сброс напряжения за счет разрыва контактов с промотором. При достижении длины около нт РНКтранскрипт достигает района 4 асубъединицы, который взаимодействует с доменом субъединицы и перекрывает канал выхода РНК. Дальнейшее удлинение РНК должно приводить к окончательной диссоциации асубъединицы и образованию активного элонгационного комплекса Рис. Д. Следует отметить, что а сохраняет способность связываться с элонгационным комплексом в процессе синтеза РНК , i . Связывание а с элонгационным комплексом может вызывать паузы в. РНК, что имеет регуляторное значение i .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.218, запросов: 145