Характеризация комплекса BBS белков и его роли в формировании и функциональной активности ресничек и микротрубочек клеток человека

Характеризация комплекса BBS белков и его роли в формировании и функциональной активности ресничек и микротрубочек клеток человека

Автор: Локтев, Александр Валерьевич

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Кольцово

Количество страниц: 115 с. ил.

Артикул: 4261982

Автор: Локтев, Александр Валерьевич

Стоимость: 250 руб.

1.1. Введение.
1.2. Ультраструктура и механизм сборки жгутиков и ресничек
1.2.1. Ультраструктура жгутиков и первичных ресничек
1.2.2. Процесс формирования ресничек в клетке.
1.2.3. Молекулярные механизмы сборки ресничек.
1.2.3.1. Открытие внутриреснитчатого транспорта.
1.2.3.2. Моторные белки осуществляющие ВРТ
1.2.3.2. Белковый состав частиц ВРТ.
1.2.3.4. Современная модель ВРТ.
1.3. Первичные реснички и жгутики в патологии человека
1.3.1. Роль ресничек в эмбриогенезе.
1.3.2. Сенсорная функция первичных ресничек.
1.3.3. Роль ресничек в поликистозной болезни почки
1.3.3.1. Функции ресничек в почке.
1.3.3.2. Молекулярный механизм сенсорной функции ресничек в почке.
1.3.4. Роль первичных ресничек в эмбриональном развитии.
1.4. Снпдром БардеБидля
1.4.1. Описание синдрома БардеБидля
1.4.2. Мутации предопределяющие ВВБ
1.4.3. Механизм наследования синдрома БардеБидля.
1.4.4. Связь ВВ белков в первичными ресничками.
1.4.5. Генетические модели синдрома БардеБидля у мышей.
1.4.6. Функции белков у рыб i i
1.4.7. Молекулярные механизмы
1.4.7.1. Особенности первичной структуры белков
1.4.7.2. Модель функции белков у
1.4.7.3. Роль 4 в транспорте центриольных спутников.
.4.7.4. Роль белков в поляризации эпителия
1.4.7.5. Структурные особенности 6, и .
1.5. Заключение.
Глава 2. Материалы и Методы.
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Плазмиды
2.1.3. Малые интерферирующие II
2.1.4. Антитела
2.2. Основпые методы
2.2.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
2.2.2. Электрофорез
2.2.3. Количественный иммуноблот КИБ.
2.2.4. Клеточные культуры
2.2.5. Тандемная аффинная очистка белков.
2.2.6. Фракционирование ББсомы в градиенте плотности сахарозы
2.2.7. Фракционирование клеточных мембран в граднеше плотности сахарозы
2.2.8. Гельфильтрация лизатов семенников мыши и клеток
2.2.8. Трансфекция.
2.2.9. Количественная ОТПЦР кОТГПДР
2.2 Иммунопреципитация ИП
2.2 Иммунофлюорссцентная микроскопия ИФМ.
2.2 Видеомикроскопия.
2.2 Эксперименты с микротрубочками i vi
2.2 Анализ вторичной и третичной структуры
2.2 Анализ пузырьков Купфера и транспорта меланосом у .i
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Выделение и изучепне функции комплекса белков
3.1.1. Выделение и биохимическая характеризация комплекса белков.
3.1.1.1. Получение клеточной линии
3.1.1.2. Очистка и идентификация белков, ассоциированных с
3.1.1.3. Физикохимическая характеризация комплекса белков, ассоциированных с 4.
3.1.2. Роль ББсомы и центриольных спутников в формировании ресничек
3.1.2.1. Роль РСМ1 и ББсомы в формировании ЦС и ресничек.
3.1.2.2. Связывание ББсомы с мембраной первичной реснички.
3.1.2.3. Роль 5 в связывании ББсомы с мембраной реснички.
3.1.3. Роль ГТФазы 8 в формировании ресничек.
3.1.3.1. Изучение связывания ББсомы с белком i8.
3.1.3.2. Роль 8 в образовании мембран ресничек.
3.2. Идентификация и исследование функции нового белка ВВРЮ
3.2.1. Идентификация и характеризация нового белка в составе ББсомы.
3.2.1.1. Обнаружение неизвестного белка в составе ББсомы
3.2.1.2. Характеризация взаимодействия ВВРЮ с ББсомой
3.2.2. Роль ВВРЮ в образовании и функции ресничек
3.2.2.1. Роль ВВРЮ в образовании ресничек в клетках
3.2.2.2. Изучение роли ВВРЮ в функции ресничек у .i.
3.2.2.3. Корслляция экспрессии ВВРЮ с белками
3.2.3. Сравнительный анализ функций ВВРЮ и белков
3.2.4. Изучение роли ВВРЮ в регуляции стабильности и ацетилирования микротрубочек
3.2.4.1. Посттрансляционные модификации тубулина.
3.2.4.2. Исследование эффекта ингибирования ВВРЮ на посттрансляционные модификации тубулина
3.2.4.3. Исследование повышенной экспрессии ВВРЮ.
3.2.5. Изучение механизма регуляции ацетилирования МТ при помощи ВВРЮ
3.2.5.1. Роль ВВРЮ в динамике полимеризации МТ в клетках.
3.2.5.2. Исследование взаимоотношения между формированием и ацетилированием МТ
3.2.5.3. Исследование взаимодействия между ВВРЮ и 6 ,
3.3. Заключение.
Синеок используемой литературы
Список сокращений
антитела
ауб, ацтубулин ацетилированный атубулин
ВВРЮ ii i , белок взаимодействующий с ББсомой весом кДа
синдром БардеБидяа, i
i,
1 ii i 1, белок перицснтриолярного материала
i 5, домен гомологичный илскстрину в белке
8 белок группы малых ГТФаз
i8 белок стумулирующий обмен нуклеотида связанного с 8 с ГДФ на ГТФ
i i ii, клетки пигментированного эпителия сетчатки глаза человека
V vi , иротсаза вируса табачной мозаики
атуб атубулин
высокоскоростной супернатант
внутрирссничковый транспорт, i , I
ГДФ гуапозин дифосфат
Гшотуб, глотубулин дитирозинированный тубулин
ГТФ гуанозин трифосфат
ДПБП Доминантная поликистозная болезнь почек
ЗФБ зеленый фшооресцснтный белок, i,
ИБ имммуноблот
ИП иммунопреципитация
ИФМ иммунофлюоресцентная микроскопия
КИБ количественный иммуноблот
Контр. контроль
кОТПЦР количественная обратная транскрипция полимеразная цепная реакция
КФБ красный флюоресцентный белок
ЛАО локализация и аффинная очистка
ЛАОВВБ4 последовательность использованная для локализации и тандемной аффинной очистки слитая с ВВБ
миРНК малые интерференционные РНК, з1КХА
мРНК матричная РНК
МТ микротрубочки
ПААГ полиакриламидные гель
Пер. перицентрин, рспсегйпп
ПК пузырек Куифера
Полиглютубулин полиглютамилированный тубулин
ПГ1К плоскостная полярность клеток
ПТМ посттрансляционным модификациям
РГ1БН рецесивная поликистозная болезнь почек
ТАО тандемная аффинная очистка
ТАО тандемная аффинная очистка
ТМС тандемная массспектроскопия
ФБС фетальная бычья сыворотка
ФИ фосфатидилинозитол
ФОН фактор обмена нуклеотида
цомт центр организации микротрубочек
цс центриольные спутники
Введение


Однако, ни одна из этих двух активностей не позволяет в полной мере обьяснить взаимосвязь между потерей функциональной активности любого из двенадцати белков у человека и возникновением разнообразных патологических симптомов синдрома БардеБидля. Это собственно сам синдром БардеБидла и, вне сомнения, сопутствующие ему диабет и ожирение. Сегодня, но данным ВОЗ, от диабета в различных странах мира счрадает около 0 миллионов человек и приблизительно около 1,1 миллиона человек погибает ежегодно vvi. Ожирение и диабет тесно взаимосвязаны между собой, а статистические данные по ожирению не менее впечатляющие. Общее количество больных ожирением оценивается в 0 миллионов человек, а так или иначе страдает от ожирения до взрослого населения и детей проживающих в развитых странах. Поэтому исследование возможной взаимосвязи генетически обусловленных нарушений функций ресничек с развитием диабета и ожирения также актуально и принципиально важно для понимания генетических основ патогенеза всех этих заболеваний и поиска принципиально новых подходов для борьбы с этими тяжелыми заболеваниями человека. Основной целью настоящей работы являлось изучение молекулярной функции белков в клетке и поиск модели функционально объеденяющей эти белков на молекулярном уровне. Создание клеточной линии человека, позволяющей эффективно выделять белки, ассоциированные i viv с известными белками. Выделение и биохимическая очистка ассоциированых белков с их предварительной характеризацией. Исследование возможной функциональной активности белков, а также связанных с ними белков, с помощью биохимических и цитологических методов для уточнения их роли в функционировании ресничек и центросомы. Структурнофункциональный анализ белков и ассоциированных белков. В результате проделанной работы получена уникальная линия клеток человека, стабильно экспрессирующая белок 4. ББсома. Биохимическая характеризация показала, что белки, составляющие ББсому 1, 2, 4, 5, 7, 8 и 9, в условиях i viv присутствуют исключительно в составе комплекса в стехиометрических количествах, причем комплекс слабо связывается с белком центриолярных спутников РСМ1. Было показано, что ББсома внутри первичной реснички ассоциирована с мембраной реснички, тогда как в цитоплазме наблюдалась на центриолярных спутниках. Впервые были получены убедительные доказательства того, что ББсома необходима для сборки первичных ресничек и, в частности, для построения мембраны реснички. Было показано, что 1 субъединица ББсомы связывается с фактором обмена гуанозин трифосфата ГТФ для маленькой 8 ГТФазы i8 которая необходима для активации 8. Активация белка 8 с помощью белка i является необходимым этапом при слиянии мембранных везикул у основания реснички и построения мембраны реснички. Таким образом, нами впервые была предложена единая молекулярная модель развития . Она предполагает, что мутация в любом из 7 составляющих ББсому белков может существенно подавлять функцию всего комплекса в процессе сборки мембраны реснички при участии белка 8. Именно с этим может быть связан плейотропный фенотип заболевания. При характеризации белков, ассоциированных с ББсомой, был обнаружен новый консервативный белок, который получил название I. Было показано, что I является стехиометрической субъединицей ББсомы. Он необходим для сборки реснички и сборки ББсомы, как белкового комплекса. Сравнение клеточных функций белковой I позволило выявить функциональную роль I. Она заключалась в регуляции стабильности микротрубочек МТ и ацетилировании тубулина, составляющего МТ. Было продемонстрировано, что цитоплазматическая фракция I не связанна с ББсомой и необходима для поддержания стабильности МТ цитоскелета и их ацетилирования, причем эти активности не зависят друг от друга. Возможным . Таким образом, можно предположить, что ББсома осуществляет координацию между построением мембраны реснички за счет связывания с белком i8 и ацетилированиемаксонсмы реснички за счет I субъединицы. Расшифровка молекулярного механизма формирования ББсомы открывает принципиально новый подход к исследованию молекулярной основы патологии тяжелого генетического заболевания человека. Этот подход может быть полезен для поиска потенциальных мишеней для лекарственных препаратов.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.172, запросов: 145