Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и отбор из нее вируснейтрализующих антител против ортопоксвирусов

Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и отбор из нее вируснейтрализующих антител против ортопоксвирусов

Автор: Дубровская, Виктория Владиславовна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2006

Место защиты: Кольцово

Количество страниц: 130 с. ил.

Артикул: 3302736

Автор: Дубровская, Виктория Владиславовна

Стоимость: 250 руб.

1.1 СТРУКТУРА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ИХ ГЕНОВ.
1.1.1 Структура антителИ
1.1.2 Гены иммуноглобулинов.
1.1.3 Реорганизация генов иммуноглобулинов в ходе дифференцировки Влимфоцитов
1.2 ПОЛУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ
1.2.1 Фаговый дисплей.
1.2.1.1 Фрагменты антител, используемые для фагового дисплея
1.2.1.2. Фаги, используемые для дисплея фрагментов антител
1.2.2 Комбинаторные библиотеки антител человека.
1.2.2.1 Конструирование наивных библиотек.
1.2.2.2 Конструирование синтетических библиотек.
1.2.2.3. Конструирование иммунных библиотек.
1.2.3 Заключение к п. 1.2.
1.3 ОРТОПОКСВИРУСЫ
.1 Иммунный ответ при ортопоксвирусной инфекции
1.3.1.1 Клеточный иммунный ответ
.1.2 Гуморальный иммунный ответ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Растворы. я
2.1.3 Ферменты
2.1.4. Культуральные среды
2.1.5. Эукариотические клетки, бактерии и бактериофаги
2.1.6. Вирусы.
2.1.7. Используемые олигонуклеотиды.
2.2 МЕТОДЫ
2.2.1 Выделение периферических лимфоцитов из крови доноров
2.2.2 Выделение суммарной РНК из лимфоцитов периферической крови
2.2.3 Синтез кДНК.
2.2.4 Амплификация VII и УЬгенов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.
2.2.5 Конструирование линкера и объединение его VII и УЬгснами в ДНКпоследовательности, кодирующие одноцеиочечные антитела человека
2.2.6 Встраивание зсБугснов в векторную фагмиду рНЕ.
2.2.7 Приготовление компетентных клеток ТС1.
2.2.8 Электропорация
2.2.9 Амплификация библиотеки.
2.2. Аффинное обогащение библиотеки специфичными фаговыми антителами
2.2. Выделение фаговых одноцепочечных антител.
2.2. Дотблот анализ на нитроцеллюлозных фильтрах.
2.2. Иммунофермептный анализ
2.2. Выделение фагмндной ДНК методом щелочного лизиса.
2.2. ПДРФанализ отобранных v.
2.2 Трансформация клеток . i фагмидной ДНК.
2.2. Анализ экспрессии v АТ в растворимой форме отдельными клонами библиотеки.
2.2. Электрофоретический анализ белков.
2.2. Всстернблот анализ.
2.2. Исследование вируснсйтрализующей активности фаговых антител
2.2. Методика очистки одноцепочечных антител в растворимой форме на i сорбенте
2.2. Определение констант аффинности одноцепочечных антител
2.2 Очистка ортопоксвнрусных препаратов
2.2. Выделение ДНК вируса оспы коров.
2.2. Получение гибридного рекомбинантного белка 3 ВОК с использованием экспрессирующего вектора 1.
2.2. Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Г,
3.1 Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки v АТ человека против ортопоксвирусов.
3.1.1 Тестирование способности антител сывороток иммунных доноров связывать ВОВ
3.1.2 Конструирование комбинаторной иммунной библиотеки v АТ человека.
3.1.3 Оценка функционального размера библиотеки
3.2 Отбор из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующих v АТ, специфичных к белку ргАЗОЬ, и исследование их свойств.
3.2.1 Аффинное обогащение комбинаторной иммунной библиотеки клонами, продуцирующими v АТ, специфичные к белку ргАЗОЬ
3.2.2 Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против белка ргАЗОЬ
3.2.3 Отбор из обогащенной комбинаторной иммунной библиотеки клонов, продуцирующих v АТ, специфичные к ргАЗОЬ
3.2.4 Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых анти ргАЗОЬ антител
3.2.5 Исследование свойств вируснейтрализующих фаговых антиргАЗОЬ антител
3.2.6 Определение аминокислотной последовательности вируснейтрализующих v АТ, специфичных к белку ргАЗОЬ
3.3 Отбор из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующих v АТ, специфичных к ВОК, и исследование их свойств
3.3.1 Аффинное обогащение комбинаторной иммунной библиотеки клонами, иродуцирующими v АТ, специфичные к ВОК.
3.3.2 Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против ВОК.
3.3.3 Отбор из обогащенной против ВОК комбинаторной иммунной библиотеки клонов, продуцирующих v АТ, специфичные к ВОК
3.3.4 Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых антител, продуцируемых отобранными против ргАЗОЬ и ВОК клонами
3.3.5 Исследование свойств отобранных антиВОК антител.
3.3.6 Определение аминокислотной последовательности эсЕу АТ, специфичных к ВОК.
.7 Получение растворимых зсБу АТ
.8 Определение константы аффинности растворимого сРу АТ Ь9
3.4 Определение белка мишени для вируснейтрализующих сРу АТ, специфичных к ВОК.
3.4.1 Получение штамма Е.соИ, продуцирующего рекомбинантный белок ргЛЗЬ ВОК штамм Гришак
3.4.2 Исследование способности фаговых антител, нейтрализующих ВОК, связывать ргЗЗЬ
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Конструирование и характеризация библиотеки
Отбор антител против рекомбинантного белка ргАЗОЬ
Отбор антител против ВОК.
Оценка аффинности отобранных вируснейтрализующих веру антител
Определение белка мишени для вируснейтрализующих антнВОК всБу АТ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ антиген
АГА антигемагглютинирующие антитела а.о. аминокислотный остаток АТ антитело
БСА бычий сывороточный альбумин
БОЕ бляшкообразующая единица
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
ВНО вирус натуральной оспы
ВОО вирус оспы обезьян
ВОВ вирус осповакцины
ВОК вирус оспы коров
ВЭ вирус эктромелии
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ИПТГ изопропилрЭтиогалактопиранозид
ИФА иммуноферментный анализ
кДа килодальтон
к.о.е. колониеобразующая единица
МАТ моноклональное антитело
ОРТ открытая рамка трансляции
ПААГ полиакриламидный гель
ПДРФ полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
п.н. пар нуклеотидов
ПЭГ полиэтиленгликоль
ПЦР полимеразная цепная ракция
РНК рибонуклеиновая кислота
ФСБР фосфатносолевой буферный раствор
ФНОа фактор некроза опухоли альфа
ХАО КЭ хорион аллантоисные оболочки растущих куриных эмбрионов
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
гнпервариабельные фрагменты антител
Сц константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина
константный домен легкой цепи иммуноглобулина
додсцилсульфат натрия
диметилсульфоксид
дезоксинуклеотид5трифосфаты V внеклеточный оболочечный вирион фактор элонгации
каркасный фрагмент вариабельного домена антитела
I иммуноглобулин
I V зрелый внутриклеточный вирион
3Ыморфолинопропансульфоновая кислота
I 3йодо4гидрокси5нитрофенилацетат
лимфоциты периферической крови
v АТ одноцепочечное антитело
Ы,Ы,Ы,Ытетраметилэти лен диамид
V эмбриональные клетки почек зеленой мартышки
VIсывороточный вакцинный иммуноглобулин
V вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина
Vвариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина
V вариабельный фрагмент легкой цепи ксемейства
V, вариабельный фрагмент легкой цепи Хсемейства
ВВЕДЕНИЕ


Показано, что 8 из вируснейтрализующих антител специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком 3, а также с его природными аналогами в составе вирионов вируса оспы коров, осповакцины и эктромелии. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ь9. Определены аминокислотные последовательности всех полученных антител. Поскольку в данной работе получены антигенсвязывающие домены антител человека, на их основе в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могли бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилактических средств, а также терапевтических препаратов предупреждения поствакцинальных осложнений и, возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 7 Международных конференциях 6, 7 и 8 i vi i Vi Vi Женева, Швейцария, , и , ой Международной конференции ivi Барселона, Испания, , 7 v i i i i ii Москва, Россия, , Международная конференция Физикохимическая биология Новосибирск, Россия, , Международная конференция i i i ii Новосибирск, Россия, и 2 Российских конференциях III Российская научная конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Новосибирск, Россия, , VII Межгосударственная научнопрактическая конференция Оболенск, Россия, . Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением тестирования антител на наличие вируснейтрализующсй активности, которое проводилось в лаборатории химических антимикробных препаратов, руководитель к. Е.Ф. Беланов. Вместе с автором в тестировании антител принимали участие Н. И. Бормотов, З. Ф. Киселева и Т. Э. Юн. ГЛАВА 1. Возбудители бактериальных или вирусных заболеваний в процессе своей жизнедеятельности в организме хозяина, так или иначе, оказываются во внеклеточной среде. Пребывание в жидкостях организма может быть недолгим, как, например, при поражении внутри клеточным и бактериями или вирусами, или более длительным, как в случае с внеклеточными патогенами. При нормальном функционировании иммунной системы патогены и их токсины, оказавшиеся вне клеток хозяина, подвергаются действию антител эффекторных молекул, продуцируемых Влимфоцитами. Основная функция антител или иммуноглобулинов состоит в том, чтобы эффективно распознать антиген, а затем обеспечить его нейтрализацию, опсонизацию или активировать систему комплемента. Иммуноглобулины всех классов построены по общему плану. Это можно проиллюстрировать на примере молекулярной организации I рис. Молекулы I имеют характерную форму, содержащую фрагмснт и два дистальных плеча, называемых фрагментами. Каждая молекула содержит как минимум две тяжелые Н и две легкие цепи, включающие вариабельные области соответственно, V и Уц для и Н цепей, формирующие v участок, от которого зависит специфичность антитела, и константные С, осуществляющую эффекторные функции, подразделяющуюся на гомологичные домены Сц1, Сц2, СнЗ, цепь имеет один константный участок . Для молекул антител характерна доменная структура. Каждый домен, входящий в состав иммуноглобулина представляет собой молекулярное образование, построенное по принципу нескольких антипараллсльных структур, стабилизированных связями. Между Сц1 и Сц2 расположена так называемая шарнирная область, обогащенная пролиновыми остатками. Повышенное содержание пролина в данной области обеспечивает конформационную гибкость молекулы, что необходимо для более успешного взаимодействия с антигенными детерминантами, представленными на поверхности чужеродных клеток, включая бактериальные частицы ,. Антигенсвязывающий участок, или активный центр антител, формируется при взаимодействии концевых Уц и Vдоменов рис. В общей линейной последовательности аминокислотных остатков Vдоменов имеются положения более консервативные, где замены одних аминокислот на другие незначительны или даже отсутствуют, которые формируют каркасные участки или i.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.172, запросов: 145