Молекулярно-биологические и иммунохимические методы детекции ретровирусов человека

Молекулярно-биологические и иммунохимические методы детекции ретровирусов человека

Автор: Карамов, Эдуард Владимирович

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2002

Место защиты: Москва

Количество страниц: 239 с. ил

Артикул: 2300583

Автор: Карамов, Эдуард Владимирович

Стоимость: 250 руб.

Молекулярно-биологические и иммунохимические методы детекции ретровирусов человека  Молекулярно-биологические и иммунохимические методы детекции ретровирусов человека 

ВВЕДЕНИЕ .
Часть I. Обзор литературы.
Ретровирусные инфекции человека и их диагностика .
ГЛАВА I. Общие сведения о молекулярной биологии ретровирусов.
1. Геномная организация ретровирусов на примере ВИЧ1
2. Организация вириона .
3. Жизненный цикл ВИЧ1.
3.1 Проникновение в клетку
3.2 Репликация.
Синтез вирусной ДНК .
Интеграция провируса
Регуляция транскрипции
4. Морфогенез и рилизинг . 3
5. Антигенная и генетическая вариабельность ВИЧ .
Глава 2. Серологическая диагностика ВИЧинфекции.
1. Методы твердофазного иммукоферментного анализа в диагностике инфекции ВИЧ.
2. Тесты второго уровня подтверждающие а диагностике ВИЧ
инфекции.
2.1. Иммуноблотинг
2.2. Микровариант ИФА ГЮТЕША .
2.3. Рашюнммунопрсципитация в диагностике инфекции ВИЧ
2.4. Метод непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии
Глава 3. Диагностика и мониторит ВИЧинфекции на генетическом уровне
3.1 Диагностические и количественные варианты ГИДР и ее аналогов
3.2. Диагностика ВИЧинфекции на генетическом уровне методы детекции ДНК и РНК .
3.3. Подготовка пробы для анализа и использование внутреннего контроля при детекции ВИЧгенома .
3.4 Гибридизационнаи детекция размноженного фрагмента на твердой фазе
3.5. Метол анализа с помощью разветвленных ДНК I III .
3.6. Мониторинг инфекции ка генетическом уровне, определение типа циркулирующего ВИЧ .
3.7. Анализ развития инфекции по данным количественных определений
генетического материала
Глава 4. Диагностика инфекции ВИЧ2 .
Часть П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Разработка иммуноферментной тестсистемы для выявления антигена ВИЧ и антител х нему
1.1 Получение фракции анти ВИЧ гаммаглобулинов
1.2. Определение белка в препаратах антител .
1.3. Получение иммуноферментных конъюгатов
1.4. Получение вирусного антигена .
1.4.1. Культуры вируспродуцирующих клеток
1.4.2. Получение ВИЧ1 АГ для постановки ИФА
1.4.3. Получение лизатов клеток, инфицированных ВИЧ1 и ВИЧ2 .
1.4.4. Получение высокоочищенного антигена ВИЧ1
1.5. Иммобилизация антител к ВИЧ1 на планшетах для проведения ИФА
1.6. Приготовление контрольных образцов положительной К и отрицательной К сыворотох .
1.7. Приготовление субстрата для реакции ИФА
. Проведение реакции конкурентного ИФА
1.8.1. Детекция антигенов ВИЧ1 .
1.8.2. Детекция антител к ВИЧ1 .
2. Разработка метода нммуноблотанга для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ1 .
2.1. Получение иммуносорбента ИС с иммобилизованными индивидуальными белками ВИЧ1 для реакции ИБ
2.2. Получение ИС с иммобилизованными белками ВИЧ1 для реакции ДИБ
2.3. Получение ИС с иммобилизованными индивидуальными белками ВИЧ
и проведение реакции ИБ .
2.4. Рекомбинантные белки ВИЧ1 .
2.4.1. спсцнфическис антигены ВИЧ1, экспрессируемые в рекомбинантном штамме вируса осповакцины рекВОВ
2.4.2. спсцифическис антигены ВИЧI. экспрессируемые врекВОВ V
2.4.3. спецнфяческис антигены ВИЧ1, экспрессируемые в .i, содержащей рекомбинантную плазмиду .
2.4.4. vспсцифическис антигены ВИЧ1. зксирессирусмыс в .i .
2.4.5. и vспеиифические антигены ВИЧ1, экспрессируемые в .i.
2.5. Проведение иммуноферментной части ИБ к ДИБ .
3. Проведение реакции непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии НИФ
4. Разработка радиоичмунопреципитацнонного анализа для определения антител
к ВИЧ РИПА
4.1. Получение Iмеченого АГ ВИЧ1 и ВИЧ2 для проведения реакции радиоиммунопреципитации .
4.2. Получение АГ ВИЧ. меченого мстионином
4.3. Проведение реакции радионммунопреципнтации .
4.4. Сыворотки для определения чувсгвительноста и специфичности разработанного метода радиоиммунопрсцииитацин .
5. Сыворотки для определения специфичности и чувствительности тестсистем .
6. Коммерческие тестсистемы для определения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2 .
7. Твердофазный и конкурентный ИФА на основе синтетичесхи.ч пептидов .
7.1. Синтетические пептиды
7.2. Проведение твердофазного и конкурентного ИФА на основе синтетических пелзгидов .
7.3. ОбраГюха спектров иммуйореактивностн СГИР .
7.4. Определение УЗссротипа .
7.5. Синтетические пептиды, применявшиеся для идентификации
иммунореакгивных эпитопов в белках Тлимфотропного вируса человека типа
V1 .
. Детекция и анализ вирусспецифических ДНК при ВИЧинфекции
8 1.1Ьлучение препаратов ДНК .
8.2. Праймеры и зонды
8.3. Проведение полимеразной цепной реакции ПЦР
Часть 1. Собственные исследования .
Глава 1. Разработка методов определения антигенов ВИЧ1 и антител к нему и оценка их репрезентативности .
1.1. Разработка конкурентного иммуиофермеитного анализа и оценка его репрезентативности .
1.2. Иммунофсрмснтная система для обнаружения антител в составе комплексов с антигенами ВИЧ1 .
1.3. Разработка метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальным белках ВИЧ1
1.4. Изучение возможности использования рекомбинантных белков для диагностики инфекции ВИЧ1
1.4.1. Изучение иммунологических свойств специфических антигенов ВИЧI. экспрессируемых в рекомбинантном штамме вируса осповакцины рек ВОВ методом КИФА и ИБ .
1.4.2. Изучение иммунологических свойств спсцифнчссхнх антигенов ВИЧ1. экспрессируемых в рскВОВ методом иммуноблотинга
1.4.3. Изучение иммунологических свойств спсцнфичсскнх антитенов. экспрессируемых в .i, содержащей рекомбинантную плазмиду , методом иммуноблотинга
1.4.4. Изучение иммунологических свойств vспсцифичсских антигенов ВИЧ1. экспрессируемых в .i методом КИФА
1.4.5. Изучение иммунологических свойств рекомбинантных белков и v ВИЧ1, экспрессируемых в . i методом иммуноблотинга .
1.5. Разработка модифицированного метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ2 .
1.6. Разработка метода радноиммунопрештптащш для определения антител к
ВИЧ1 и ВИЧ2 и оценка его репрезентативности .
1.6.1. Сравнение методов радиоиммунолреципигации и иммуноблотинга в
серодиагностике инфекции ВИЧ
1.6.2. Использование метода радионммунопрештитацни в ссроэпидемиологических обследованиях групп риска для тестирования сывороток, имеющих сомнительные результаты иммуноблотинга
1.6.3. Определение антител к ВИЧ2 методом радиоиммунопрсципитации
. Идентификация нммунореактивности эпитопов в белках, кодируемых генами , v и Тлимфотропного вируса человека типа 1 V1 с использованием синтетических пептидов
. Изучение иммунорсактннносги ВИЧпознтквных сывороток методом ИФА на основе синтетических пептидов
1.8.1. Иммунорсактивностъ ВИЧпозитивных сывороток к 3нмнтирукшнм пептидам в процессе развития инфекиии .
1.8.2. Динамика уровня иммунореактивности ВИЧпозитивных сывороток к V3им пирующим пептидам в процессе развития
инфекции.
1.9. Метод непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии
Глава 2. Детекция и анализ вирусспсиифических ДИК и РНК при ВИЧипфекции
2.1. Детекция провируса в ДНК лимфоцитов. Мониторинг ВИЧинфекции на генетическом уровне .
2.2. Препараты ДИК, праймеры и зонды
2.3. Детекция провнруса ВИЧ с анализом гибрида е.тьзлекрофорезом .
2.4. Гибридизация со связыванием на ГАП .
2.5. Комбинация ПЦРтранскрнпиия
2.6. Анализы проб из крови пациентов
2.7. Разработка метода количественной оценки вирусспсцифичсских ДНК и РНК при ВИЧинфекции
2.8. Конструирование внутренних стандартов для количественной ДНК. РНК
ПЦР и изучение их свойств в модельной системе .
Глава 3. Альтернативные лабораторные методы детекции ВИЧ
3.1. Разработка метода диагностики ВИЧинфекций, основанного на принципах лантанидного иммунофлуоресцентного анализа ЛИФА, с использованием импортной аппаратуры н реактивов. Разработка отечественного аппаратурного и реактивного обеспечения для конструирования тестсистем на основе ЛИФА
3.1.1. Разработка методов диагностики ВИЧинфекций с помощью ЛИФА. Определение уровня антител к ВИЧ в сыворотках крови людей с помощью белка
А, меченного ионами европия
3.1.2. Разработка конкуренткой тестсистемы ЛИФА ятя выявления антител к белку р в сыворотках крови человека .
3.1.3. Разработка отечественного и реактивного обеспечения для конструирования ЛИФЛсистем .
3.2. Разработка экспресс метода диагностики ВИЧинфекции с помощью мишсньчувствительных липосом .
3.3. Метод ЭПР для детекции ВИЧ .
3.4. Методы электронной микроскопии для детекции ВИЧ
Выводы
Список работ, опубликованных по теме диссертации .
Библиографический список
Введение.
Актуальность


Вначале происходит первичное связывание вируса с районом т. После этого, в обнажается новый сайт для связывания с корецептором в зависимости от типа вируса, это может быть 5 или X4. Такая ассоциация приводит к тримеризации комплекса, что приводит к внедрению гидрофобного 4 фрагмента в клеточную мембрану, слиянию вирусной и клеточной мембран и проникновению вируса. В настоящее время известно уже кореценторов, определяющих спектр тропизма тех или иных штаммов вирусов иммунодефицита. Следует отметить, что мы в свое время указали на роль интегриновых рецепторов, как специальных кофакторов проникновения ВИЧ в клетку, а также предложили одну из первых моделей этого процесса. Открытие вирусных кореценторов обозначило новые направления в изучении ВИЧинфекции. Ведугся работы по созданию трансгенных животных, экспрессирующих 4 человека и соответствующий корецептор, которые могут стать моделями ВИЧ инфекции i viv. Получено более моноклональных антител к корецепторам, молекулантагонистов, пептндомнметиков, производных ССхс. И хотя получены интересные результаты, есть и удручающие факты. Так например, вещество , относящееся к классу т. ООО до 6 в разных биологических системах блокировало ВИЧинфекцню, обусловленную только Ттропными вирусами, т. СХСЯ4 корсцептор. Через пассажа возникал мутантный вирус, который имел аминокислотных замен, которые делали его нечувствительным к бицнкламам , , . Так что на этом пути предстоит еще большая работа. Репликация. Син тез вирусной ДНК. Практически у всех ретровирусов этот процесс идентичен. Обратная транскрипция вирионной РНК в двуспиральную линейную ДНК начинается уже в вирноне и ускоряется по мере проникновения вируса в клетку. При этом возникают две сложнейшие проблемы, которые необходимо решить вирусу, если ему известны правила синтеза клеточных ДНК вопервых, поскольку для синтеза новой цепи ДНК нужна РНКзатравка, то вновь синтезируемая ДНКкопия генома будет неполной. Вовторых, так как геномная РНК является продуктом клеточной РНКполимеразы II, то вирус должен обеспечить наличие сигнальных последовательностей, лежащих до участка инициации синтеза РНК, которые оказались бы вне участка, подлежащего копированию. Совершенно очевидно при этом, что эти сигнальные последовательности не войдут в геномную РНК и будут утеряны вирусным потомством. Ретровирусы элегантно решают две сложные биохимические проблемы с помощью 2х идентичных 1 Так как сигнальные последовательности лежат именно в ЫЯ, наличие их копии на 5конце провирусной ДНК обеспечивает их присутствие в составе синтезируемой геномной РНК. РНК являются т. Д1П цепей на комплементарные участки противоположного конца генома с образованием двух колец и последующим продолжением синтеза. Такие переносы обеспечивают копирование участка РНКзатравки, а также восстановления двух копий з составе провирусной ДНК. Интеграция провнруса. Это уникальная стадия жизненного цикла рстровирусоз. Синтезированная в цитоплазме вирусная ДНК входит в состав т. НК. НК состоит из провирусной ДНК, , I, и v. Важной особенностью ВИЧ является его способность заражать неделящиеся клетки. То есть ПК взаимодействует с клеточной ДНК. Используя сигналы ядерной локализации в и v, НК активно зранспортируется в ядро. Провирус ВИЧ1 имеет ту же очередность генов, что и вирионная РНК. Но в провирусе вирусная ДНК утрачивает по два основания на каждом конце генома, а границами для всех интегрированных последовательностей являются основания на 5конце и СА на 3конце. При интеграции шесть пар оснований в клеточной ДНК дуплицируются на обоих концах генома. Механизм интеграции включает п себя последовательное образование свободных не спаренных концов клеточных ДНК, их легирование с концами вирусной ДНК и последующее достраивание не спаренных оснований клеточных ДНК системой репарации. Интеграция провируса происходит в случайном месте. Однако известно, что ВИЧ1 предпочитает I и последовательности клеточных ДНК для интеграции. Считается, что так расположены в структуре хроматина, что клеточная ДНК легкодоступна для вирусных РНП.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.252, запросов: 145