Молекулярный механизм реакций расщепления и элонгации РНК-транскрипта, катализируемых ДНК-зависимой РНК-полимеразой E. coli

Молекулярный механизм реакций расщепления и элонгации РНК-транскрипта, катализируемых ДНК-зависимой РНК-полимеразой E. coli

Автор: Сосунова, Екатерина Владимировна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2004

Место защиты: Москва

Количество страниц: 153 с. ил.

Артикул: 2626774

Автор: Сосунова, Екатерина Владимировна

Стоимость: 250 руб.

Молекулярный механизм реакций расщепления и элонгации РНК-транскрипта, катализируемых ДНК-зависимой РНК-полимеразой E. coli  Молекулярный механизм реакций расщепления и элонгации РНК-транскрипта, катализируемых ДНК-зависимой РНК-полимеразой E. coli 

ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность темы
Цель работы и задачи исследования
Научная новизна и практическая ценность работы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
I. Структура многосубъеднничных ДНКзависнмых РНКполимераз
Общие сведения о РНКП и транскрипционном цикле.
Паузированис и бэктрэкинг .
Структу рные особенности РНКП
Структу рнофункциональная модель тройного
элонгационного комплекса.
И. Структу рнофункциональная модель активного центра РНКП.
Двуметаллический механизм катализа.
Механизм катализа многосубъединичиой РНКП
Характеристика реакции экзонуклеазного расщепления.
Влияние мутационных замен в субьединице РНКП . i
на ЗБэкзонуклеазную активность.
Молекулярное моделирование активного центра РНКП . i.
III. Другие механизмы катализа нуклеотидилтрансферазной реакции.
С участием одного иона .
Кислотноосновной механизм катализа без ионов Ме2.
IV. Эндонуклеазное расщепление РНК, катализируемое РНКП.
Нестимулирусмое эндонуклеазное расщепление
Факторстимулируемое эндонуклеазное расщепление РНК.
V. Структу ра факторов.
Доменная организация факторов
Поверхностное распределение зарядов. Роль положительно
заряженного кластера аминокислотных остатков концевого домена.
Функции факторов.
Анти факторы.
VI.Структура и функции II.
Доменная организация II.
Функции II
Структура комплекса РНКП с разрешением 3.8А.
Взаимодействия II с другими компонентами транскрипции
Примеры действия белковых факторов как подвижных
каталитических компонентов активного центра.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, плазмиды
Реактивы
Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Электрофорез нуклеиновых кислот в денату рирующем геле.
Белковый электрофорез.
Получение промоторных фрагментов ДНК
Получение РНКполимеразы . i.
Буферы, использовавшиеся при выделении субъединиц
и реконструкции РНКП Е.соИ.
Выделение субъединиц.
Выдезение асубъединицы
Выделение осубъединицы.
Сборка и очистка РНКполимеразы Е
Выделение клеточной РНКП
Выделение факторов.
Получение мутационных замен в РНКП и
Получение РНКП с мутационными заменами
Получение с мутационными заменами , .
Условия реакций, катализируемых РНКП Е. .
Анализ активности ТЭК и продуктов реакций
Получение транскрипционных комплексов.
Условия реакции полимеризации и пирофосфоролиза.
Условия реакций экзо и эндонуклеазного расщепления.
Введение модифицированных нуклеотидных субстратов в
РНКтранскрипт.
Реакции расщепления РНК, катализируемые щелочной фосфатазой
АР, фосфодиэстеразой змеиного яда V и рибонуклеазой Т
Метод е2индуцированного расщепления.
Получение ковалентных сшивок РНКП с
Получение химических модификаций.
Синтез А ТРаСН.
Синтез цитидин5 фосфат2 3метилфосфаната.
Синтез цитидин5 трифосфат3 метилфосфата.
Идентификация продуктов РНК расщепления в ТЭК
методом ТСХ на I целлюлозе
Определение , , V
Компьютерное моделирование.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
I. Механизм стимуляции реакции эндонуклеазного расщепления РНК
факторами
факторы резко увеличивают константу связывания II
в активном центре РНКполи.меразы
Анализ возможности аллостерического механизма действия факторов
на связывание каталитического иона II.
Моделирование комплекса РНКполимеразы с
Контакты РНК с в транскрипционном элонгационном комплексе
Мутационные замены , в концевом домене драматически нарушают стимулирующую активность , но
не влияют на связывание с II
Мутационные замены 4I, в концевом домене нарушают способность фактора связывать каталитический
ион II в активном центре II
факторы с мутационными заменами и 4I ингибируют
внутреннюю независимую реакцию эндонуклеазного расщепления РНК.
Мутантные факторы ингибируют элонгацию РНК в ТЭК
Заключение.
II. Механизм реакции эндонуклеазного расщепления РНК, катализируемого
РНКП в отсутствие факторов.
Эндонукзеазное расщепление значительно эффективнее
3 5 экзонуклеазного расщепления.
Связывание каталитического иона МеН в активном центре в эндонуклеазнойреакции сильнее, чем в экзонуклеазной
Эффект щелочного на связывание иона МеП в процессе
эндонуклеазной реакции
Некомплементарный НТР не влияет на скорость эндонуклеазной реакции
Фосфатная группа первого неспаренного нуклеотидного остатка в тройном
комплексе важна для эндонуклеазного расщепления.
Введение метилфосфонатной модификации в 3 конец РНКтранскрипта
Атом кислорода в ргоЯ положении фосфатной группы первого неспаренного нуклеотидного остатка РК не участвует в координации Ме, но необходим для
катализа эндонуклеазнго расщепления.
Влияние присутствия дезоксирибонуклеинового остатка в РК на скорость
эндонуклеазного расщеплен ия
Роль нуклеотидной части первого неспаренного остатка РНК в
эндонуклеаз ном расщеплении.
Роль первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК, расположенного в положении относительно 1 сайта, в Сгезависимом эндонуклеазном
расщеплении
Построение молекулярной модели эндонуклеазной реакции
Пуриновое основание первого неспаренного нуклеотидного остатка РНК
участвует в катализе эндонуклеазной реакции
Заключение молекулярный механизм Сгенезависимой эндонуклеазной реакции.
III. Влияние мутационных замен в активном центре РНКполимеразы
на реакции синтеза и деградации
Выбор и получение мутационных замен в активном центре
РНКполимеразы.
КП с мутационными заменами имеют дефекты в скорости
элонгации и увеличенные значения Кт для нуклеотидных субстратов
Мутационная замена ЕП3,4АА не влияет на связывание
каталитического иона М в реакции синтеза тримера СрАрПИЗ
Анализ влияния мутационных замен в активном центре РНКП
на 3 5 экзонуклеазную активность.4
Мутационный анализ Есайта.
Пирофосфат в активном центре РНКП может связываться
двумя альтернативными путями.
Влияние на скорость реакций гидролитического расщепления РНК,
катализируемых мутантньми РНКполимеразами
Влияние мутационных замен на эндонуклеазную реакцию
Анализ способности к бэктрэкингу РКП с мутационными заменами
методом Ее2индуцированного расщепления.
Заключение.
IV. Обсуждение результатов.
Сравнение различных структурных моделей комплекса РНКП
с транскрипционными факторами расщепления
Структурная модель комплекса РНКПСгеВ, полученная на основе
рентгеноструктурного анализа с разрешением А
Биохимический анализ взаимодействия РНКП с Сге.
Сравнение различных структурных моделей комплекса К ПС ге
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Недавно существование ТЭК в состоянии бэктрэкинга и транскрипционной паузы было напрямую показано i vi методом оптических ловушек i i с высоким разрешением 0. РНКП на одну нуклеотидную пару vi . Суть метода оптических ловушек заключается в следующем. Остановленный ТЭК, в котором к поверхности РНКП и к концу ДНК матрицы присоединены полистиреновые гранулы рис. А, помещается в специальный оптический зажим. Устройство, позволяющее фиксировать положение гранул, представляет собой инвертированный микроскоп с двумя лазерами улавливающим и детектирующим. Сила лучей настраивается таким образом, чтобы соотношение прочностей ловушек различалось не менее чем на порядок, в результате чего в основном движение будут совершать гранулы, удерживаемые менее прочной ловушкой Эти гранулы менее прочно удерживаемые освещаются лучом детектирующего лазера, рассеянный свет проецируется на специальный детектор, расположенный в плоскости, сопряженной с задней фокальной плоскостью конденсора. Полученный сигнал усиливается и переводится в электронный вид Энергия улавливающего лазера достаточно большая, чтобы предотвратить броуновское движение. Рис. Схема и применение метода оптических ловушек БЬяеуЙг е1 а1. А Экспериментальная схема метода оптических ловушек. Две гранулы I и II, присоединенные к ДНК и РНКП. Гранулы I удерживаются на порядок прочнее чем II. В процессе элонгации РНКП двигается по ДНК. С помощью описанного метода было показано vi . РНКП претерпевает два типа пауз пауз короткие, с временем жизни, исчисляемым секундами, 5 пауз длинные, с временем жизни от сек до мин. ДНК и случаются с частотой приблизительно 1 раз на , что соответствует скорости иисинкорпорации в процессе синтеза РНК i . Примечательно, что бэктрэкинг наблюдается только в случае длинных пауз, и его можно непосредственно наблюдать в записи транскрипционного движения РНКП рис. В vi . Помимо большого количества накопленных биохимических данных, в последнее время был осуществлен настоящий структурный прорыв в изучении РНКП. Были получены трхмерные структуры кор и холофермента в свободном состоянии и в комплексе с ДНКРНК гибридом бактериальной РНКП Т. РНКП . Vv . РНКполимеразы II . На основании этих структур были созданы пространственные модели промоторного и элонгационного комплекса и предложены механизмы взаимодействия РНКП с нуклеиновыми кислотами в элонгационном комплексе. Сопоставление структурных данных с биохимическими привело к созданию структурнофункциональной модели ТЭК v . Сравнение полученных структур позволило многое узнать о конформационной подвижности РНКП на всех стадиях транскрипции. В настоящее время показано, что значительные структурные перестройки субъединиц РНКП, осуществляются при узнавании и плавлении промоторов, связывании и диссоциации стсубъединицы в ходе инициации транскрипции. На стадии элонгации каждый акт присоединения нуклеотида, также сопровождается конформационными изменениями в районе активного центра РНКП. Тсрминация транскрипции сопряжена с серьезными изменениями всей структуры элонгационного комплекса. Однако детальные механизмы конформационных перестроек I1КП во всех рассмотренных случаях до конца не изучены. Структурная гомология эукариотической РНКПИ и бактериальной РНКП выражена гораздо сильнее, чем гомология в аминокислотной последовательности i, , . Структура активного центра оказывается практически идентичной в случае разных РНКП. Большинство структурных доменов пяти основных субъединиц гомологов , , , и со имеют сходную архитектуру у обоих ферментов i, . В составе РНКПИ обнарживаются многие, характерные структурные элементы, присущие бактериальной РНКП мостовая спираль, зажим , шип , крышка i, застежка i, подвижную заслонка xi в случае РНКПI, и 2i выступ i и доля в случае РНКП II рис. Наиболее функционально важные структурные элементы РНКП будут рассмотрены ниже. Структура корфермента бактериальной РКП по своей форме напоминает клешни краба, между которыми проходит главный канал диаметром А, изогнутый приблизительно под прямым углом рис. Одна из клешней и часть канала образована субъединицей, другая клешня и часть канала субъединицей.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.447, запросов: 145