Гибридизационные подходы в широкомасштабных исследованиях геномов

Гибридизационные подходы в широкомасштабных исследованиях геномов

Автор: Ажикина, Татьяна Леодоровна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 210 с. ил.

Артикул: 4299048

Автор: Ажикина, Татьяна Леодоровна

Стоимость: 250 руб.



При этом в работе линкеры для последующего ПЦР были лигированы к трейсерной ДНК либо до проведения ВГ i . По контрасту с этими работами Лисицын с соавторами разработали протокол ВГ, в котором для амплификации трейсерспецифических дуплексов использовались 5 выступающие одноцепочечные адаптеры ii . Для создания таких выступающих адаптерных концов использовали дуплекс, образованный нефосфорилированными на 5 конце олигонуклеотидами. После лигирования такого дуплекса с фрагментами ДНК, содержащими 5фосфатные группы, только одна из цепей адаптера ковалентно связывалась с фрагментом ДНК, а вторая денатурировала. В I
модельном эксперименте по выделению фрагментов плазмидной ДНК, добавленной к геномной ДИК . Использование ПЦРамплификации позволило существенно усовершенствовать метод вычитающей гибридизадии. Так, в работе i . ДНК локуса, ассоциированного с мышечной дистрофией Дюшснна длина делеции составляла 1 4 т. ОДНОЦСЛОЧСЧН1. Рис. Схема геномного вычитания, основанная на ПЦРамплифнкацнн двухцепочечного трейсера ii . Этот метод был также успешно использован для получения геномной библиотеки, обогащенной последовательностями, делегированными при раке легкого i . Однако, хотя эти введение в методику ПЦР существенно улучшило ВГ, достигаемые степени обогащения были все еще недостаточны для использования в случае делений небольших размеров. В году Лисицын и соавторы описали новый метод, основанный на принципах вычитающей гибридизации, для поиска небольших различий между двум я сложными геномами ii . Прежде всего, была введена стадия понижения сложности двух сравниваемых ДНК, проводимая перед вычитающей гибридизацией. Для этой цели ДНК драйвера и трейсера расщепляли рестрикционной эндонуклеазой редкощепящей I, или i. К полученным фрагментам присоединяли олигонуклеотидные адаптеры и осуществляли ПЦРамплификацию с соответствующими этим адаптерам праймерами. После циклов ПЦР в смеси преобладали фрагменты с размером менее 1 ООО п. В результате такой обработки драйвер и трейсер превращались в более или менее случайную выборку из первоначальной смеси фрагментов. Степень упрощения рассматриваемая как уменьшение сложности варьировалась в зависимости от используемой рестриктазы для I, и iI это было , и 8 соответственно. Упрощенные фрагментированные геномы, т. ВГ. Помимо меньшей сложности они характеризовались тем что, 1 размер индивидуальных фрагментов находился в близком диапазоне длин, 2 все фрагменты ампликона можно было амплифицировать. После того как трсйсерная и драйверная ДНК были приготовлены, их адаптеры удалялись с помощью рестриктазы, и только фрагменты трейсера лигировали с новыми адаптерами рис. З. После денатурации и ренатурации с избытком драйвера проводили достраивание выступающих концов молекул с помощью ДНКполимеразы. ДНК, то только целевые дуплексы могли быть амплифицированы экспоненциально. Все одноцепочечные молекулы или продукты линейного ПЦР удалялись обработкой нуклеазой, специфичной для одноцепочечной ДНК. Рис. З схема вычитающей гибридизации с предварительной стадией понижения сложности сравниваемых геномов ii . Двухцепочечные фрагменты амплифицировали, удаляли адаптеры обработкой соответствующей рестриктазой и лигировали новые адаптеры. Новый трейсер использовался в ВГ с новой порцией драйвера, т. ВГ повторялась. Каждый новый раунд ВГ давал дополнительное обогащение молекулмишеней, в том числе и за счет увеличения скорости реассоциации обогащенных в предыдущем раунде фрагментов в согласии с кинетикой реакций второго порядка. Математическая обработка данных эксперимента ii . ВГ молекуламимишенями рис. Рис. Процентное содержание различных типов последовательностей в амплификате после нескольких раундов ВГ в условиях, описанных в ii . Математическая модель построена исходя из следующих предположений геномная ДНК трейсера содержала уникальных последовательностей, последовательность мишени представлена одной копией на геном. В гибридизации использовали двухцепочечные драйвер и трейсер в количествах и 0. ВГ проводили в течение 2 ч, после кратного упрощения геномов а, без упрощения б. Работа ii .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.186, запросов: 145