Дизайн рекомбинантных антител

Дизайн рекомбинантных антител

Автор: Тикунова, Нина Викторовна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2007

Место защиты: Кольцово

Количество страниц: 288 с. ил.

Артикул: 4020656

Автор: Тикунова, Нина Викторовна

Стоимость: 250 руб.

Введение.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Иммуноглобулины
1.1.1. Строение антител на примере молекулы .
1.1.2. Строение вариабельных доменов иммуноглобулинов
1.1.3. Организация генов, кодирующих иммуноглобулины.
1.2. Типы рекомбинантных антител
1.2.1. Миниантитела на основе гипервариабельных участков и УН
домснов.
1.2.2. РаЬ и Буфрагменты.
1.2.3. Одноцепочечные антитела.
1.2.4. Производные одноцепочечных антител и РаЬфрагментов.
1.2.5. Продукция миниантител в клетках Е.соН
1.2.6. Химерные антитела.
1.2.7. Гуманизированные антитела
1.2.8. Рекомбинантные полноразмерные антитела человека.
1.2.9. Продукция рекомбинантных полноразмерных антител в эукариотических клетках
1.3. Получение рекомбинантных антител методом фагового дисплея
1.3.1. Фаговый дисплей история вопроса
1.3.2. Строение и жизненный цикл нитчатого бактериофага
1.3.3. Типы векторных систем на основе нитчатых бактериофагов
1.3.4. Комбинаторные фаговые библиотеки пептидов.
1.3.5. Комбинаторные фаговые библиотеки антител
1.3.6. Типы фаговых библиотек антител
1.3.7. Комбинаторные фаговые библиотеки на основе РаЬфрагментов
1.3.8. Комбинаторные фаговые библиотеки на основе одноцепочечных антител
1.3.9. Конструирование наивных библиотек.
1.3. Ю.Конструирование синтетических библиотек.
1.3. .Конструирование иммунных библиотек.
1.4. Заключение к главе 1.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Использованные в работе материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Растворы
2.1.3. Ферменты
2.1.4. Олигонуклеотиды.
2.1.5. Культуральные среды
2.1.6. Эукариотические клетки и бактерии
2.1.7. Вирусы и бактериофаги
2.1.8. Плазмиды.
2.2. Основные методы.
2.2.1. Очистка ортопоксвирусов
2.2.2. Выделение ДНК ортоиоксвипусов
2.2.3. Выделение периферических лимфоцитов из крови доноров.
2.2.4. Выделение РНК
2.2.5. Синтез кДНК
2.2.6. Амплификация фрагментов ДИК
2.2.7. Синтез ояигос1СКконнекторов на 3концах фрагментов кДНК
2.2.8. Ферментативный гидролиз ДНК.
2.2.9. Встраивание фрагментов ДНК в векторную плазмиду фагмиду
2.2 Трансформация клеток . i плазмидной фагмидной ДНК
2.2 Приготовление олигонуклеотидных зондов.
2.2 Гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах
2.2 Выделение плазмидной фагмидной ДНК.
2.2 Электрофоретическое фракционирование ДНК.
2.2 Элсктроэлюция фрагментов ДНК.
2.2 ПДРФанализ
2.2 Определение и анализ нуклеотидных последовательностей ДНК
2.2 Электрофоретический анализ белков
2.2 Амплификация комбинаторной библиотеки
2.2 Аффинное обогащение библиотеки специфичными фаговыми антителами.
2.2 Выделение фаговых антител
2.2 Дотблот анализ на нитроцеллюлозных фильтрах.
2.2. Анализ экспрессии v АТ в растворимой форме отдельными
клонами библиотеки.
2.2 Твердофазный иммуноферментный анализ.
2.2 Вестсрнблот анализ
2.2 Конкурентный иммуноферментный анализ.
2.2 Приготовление субклеточных фракций клеток .i.
2.2 Очистка одноцепочечных антител с помощью хелатной хроматографии
2.2 Трансфекция эукариотических клеток плазмидными ДНК.
2.2 Наработка полноразмерных антител человека в эукариотических клетках
2.2 Очистка полноразмерных антител с помощью аффинной хроматографии
2.2 Определение констант аффинности рекомбинантных антител
2.2 Исследование вируснейтрализуюшей активности рекомбинантных антител против ортоиоксвирусов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Конструирование одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита и исследование их свойств.
3.1.1. Клонирование генов, кодирующих V и VI домены МКА антител против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита.
3.1.2. Конструирование гена, кодирующего одноцепочечное антитело
3.1.3. Продукция сконструированного одноцепочечного антитела в
клетках .i.
3.1.4. Исследование иммунохимических свойств одноцепочечных антител против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита в составе клеточных лизатов
3.1.5. Конструирование димерных одиоцепочечных антител.
3.1.6. Продукция димерных антител в клетках .i.
3.1.7. Очистка рекомбинантных антител
3.1.8. Исследование иммунохимических свойств мономерных и димерных одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита.
3.2. Конструирование комбинаторных библиотек одиоцепочечных
антител человека.
3.2.1. Конструирование иммунной библиотеки одноцепочечных антител
человека
3.2.2. Характеризация иммунной библиотеки
3.2.3. Конструирование неиммунной наивной библиотеки одноценочсчных антител человека и ее характеризация.
3.2.4. Отбор фаговых антител против ФНОа, НВсантигена и вируса осповакцины.
3.2.5. Исследование отобранных фаговых антител против Ф1Юа человека
3.2.6. Определение констант аффинности отобранных антител против ФНОа человека
3.3. Получение рекомбинантных антител против вируса Эбола и исследование их свойств.
3.3.1. Селекция одноцепочечиых антител человека против вируса Эбола
из комбинаторных библиотек
3.3.2. Исследование иммунохимических свойств одноцепочечных антител, отобранных из синтетической и натуральной библиотек
3.3.3. Конструирование полноразмерного антитела человека против
вируса Эбола
3.3.4. Исследование иммунохимических свойств полученных полноразмерных антител человека против вируса Эбола.
3.4. Конструирование рекомбинантных антител человека против ортоноксвирусов и исследование их свойств.
3.4.1. Получение препаратов ортоноксвирусов
3.4.2. Отбор одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов из комбинаторных библиотек
3.4.3. Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих отобранные одноцепочечные антитела против ортопоксвирусов.
3.4.4. Исследование связывания отобранных фаговых антител с
различными ортопоксвирусами, включая штаммы вируса натуральной оспы
3.4.5. Исследование вируснейтрализующих свойств отобранных одноцепочечных антител
3.4.6. Исследование антшенной специфичности отобранных антител
3.4.7. Оценка констант аффинности отобранных одноцепочечиых
антител.
3.4.8. Конструирование полноразмерных антител человека против ортопоксвирусов.
3.4.9. Исследование иммунохимических свойств полноразмерных
антител против ортопоксвирусов
3.4 Исследование вируснейтрализующей активности полученных полноразмерных антител против ортопоксвирусов.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Домены константного района тяжелых цепей кодируются отдельными сегментами незакрашенные прямоугольники. Генные сегменты М1 и М2 кодируют мембранный компонент. Кроме того, существует группа 1генов 5 экзонов, кодирующих несколько последних аминокислот Удомена. Организация кластера генов, кодирующих тяжелые цепи, локализованного на хромосоме, несколько сложнее. Угены, представленные несколькими сотнями копий, кодируют лидерный сегмент и собственно вариабельный домен. Дополнительно имеются фугшы Эгенов экзонов и группы Г генов 4 экзона. Е, А. Сн2, Сцз доменам и шарнирному участку, а также по два Мсегмента, которые определяют представленность соответствующей молекулы иммуноглобулина в мембрансвязанной или сскретируемой форме. Организация генов, кодирующих иммуноглобулины человека, несколько различается. Мультигенное семейство, кодирующее тяжелые цепи, состоит приблизительно из функциональных V тенных сегментов, которые локализованы перед функциональными генными сегментами, и расположено на хромосоме i, . Каждому Vсегменту предшествует короткая лидерная последовательность. Сразу за Онсегмснтами располагаются 6 функциональных i. Реорганизованные Унгены могут быть сгруппированы в 7 семейств. Объединение в семейства зависит от гомологии последовательностей, а размер семейств может варьировать от одного члена например, V6 до ух VI. За сегментами следует серия Сн генных сегментов, каждый из которых кодирует константный район тяжелой цепи иммуноглобулина определенного изотипа и, б, у, е и. Сцсегмснты расположены на хромосоме в определенном порядке, соответствующем последовательной наработке иммуноглобулинов различных классов в ходе созревания и дифференцировки Влимфоцитов. Па хромосоме 2 расположены около функциональных V генных сегментов, пять сегментов, и один Ск сегмент Сох. Гены, кодирующие Укдомены объединяют в 6 семейств. Группа сцепления генов, кодирующих легкие цепи А. V. генных сегментов, четырех x сегментов и семи С. Кроме того, эта группа содержит много V. С. псевдогенов. Реорганизованные Vгены сгруппированы в семейств ii . Зародышевые гены иммуноглобулинов в организме используются избирательно i . Сох . Ivi . Унгенов из 5 семейств, что составляет около всех Унгенов. Иммуноглобулины из Унг семейства обнаруживаются очень редко. Активно участвуют в иммунном ответе только 4 из шести Ук семейств зародышевых генов, из которых составляют 7 генов. Использование генов зародышевой линии УХ ограничено 3мя семействами, которые используются в случаев, и 5 генов из этих семейств экспрессируются особенно часто i . В настоящее время считается, что основной источник разнообразия антител кроется в строении генов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов. Вопервых, эго разнообразие генов, представленное в мультигенных семействах зародышевых клеток предшественников Влимфоцитов. Вовторых, вклад в разнообразие вносят комбинации разных сегментов Vгенов и комбинации соединения отдельных сегментов по разным точкам, т. V и или V, и ссгмснтов не является строго фиксированным. В Унгенах дополнительным источником разнообразия является рекомбинация сегмеитов иили включение новых нуклеотидов но месту рекомбинации ферментом дезоксинуклеозидтрансферазой, которая акгивна в лимфоцитах. Втретьих, случайное объединение вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей в единый антигенсвязывающий сайт также обеспечивает увеличение разнообразия антител. Наконец, соматические мутации Vрайонов шрают важную роль в генерации разнообразия антител. Скорость мутационного процесса в Vгенах оценивают как 1 мутация на клеточное деление, что примерно в миллион раз больше частоты спонтанного мутирования в других iенах . В процессе иммунного ответа структура Vрайона эволюционирует, начиная с выбора соответствующих генных Vсегментов и их комбинаций, и в дальнейшем за счет выбора структурных вариантов этих районов, получаемых в результате соматических мутаций, которые происходят с высокой частотой вслед за антигенной стимуляцией. Соматическая эволюция при первичном иммунном ответе в значительной степени улучшаег структуру и функциональные характеристики Урайона .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.218, запросов: 145