Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей

Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей

Автор: Романова, Нина Владимировна

Шифр специальности: 03.00.02

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2004

Место защиты: Москва

Количество страниц: 135 с. ил.

Артикул: 2869674

Автор: Романова, Нина Владимировна

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ СЕКРЕТОРНЫЙ ПУТЬ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Введение.
1. Общая организация секреторного пути.
1.1. Транслокация белка из цитозоля в эндоилазматичсский рстикулум ЭР
1.2. Внутриклеточная система транспорта секреторных белков.
1.2.1. Комплексы окаймления СОРИ и СОР1 участвуют в транспорте белков между
ЭР и аппаратом Гольджи.
1.2.2. Клатриновое окаймление участвует в транспорте белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в лизосомы вакуоль, от плазматической мембраны в аппарат Гольджи или лизосому вакуоль.
1.2.3. Секретируемые белки покидают эукариотическую клетку преимущественно конститутивным образом
1.2.4. Слияние транспортных везикул с мембранами происходит при участии цитозольных и мембранных белков.
1.3. Сортировка секреторных белков в секреторных путях.
1.3.1. Сортировка растворимых белков.
1.3.2. Сортировка мембранных белков, проходящих начальные этапы секреторного
1.3.2.1. Сигналы локализации белков в мембранах аппарата Гольджи.
1.3.3. Сигналы сортировки трансмембраниых белков в лизосомы
1.4. Модификации секреторных белков
1.4.1. Гликозилироваиие
V 1.4.1.1. Кгликознлнрование
1.4.1.2. Огликозилирование
1.4.2. Протеолитический процессинг.
2. Контроль качества укладки белков в ЭР Е2С
2.1. Сборка и укладка белков происходит в ЭР
2.1.1. В дрожжах . vii идентифицированы сборочные факторы.
2.2. Контроль качества укладки белков в ЭР
2.2.1. Роль моноглюкознлированных гликозидов в системе контроля качества
2.2.2. Роль кальнексина и кальретикулина в системе контроле качества
2.3. Модель контроля качества укладки белков в ЭР млекопитающих.
2.4. Контроль качества укладки белков отличается у дрожжей . ,
.vii и млекопитающих 3
2.5. Маннозидаза I участвует в формировании сигнала для системы деградации неправильно свернутых белков.
2.6. Альтернативные модели системы контроля качества в клетках млекопитающих
2.7. в комплексе с кальнексиномкальретикулином способствует правильной укладке белков.
2.8. Модель контроля качества укладки белков в дрожжах . vii контроль качества без участия кальнексина, кальретикулина и глюкозилтрансферазы
2.9. Гомолога компонентов системы укладки белков в дрожжах .
3. Ответ клетки на накопление неправильно свернутых белков
3.1. НА С1активация механизма
4. Деградация белков в секреторном пути.
4.1. Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом
4.1.1. Компоненты система убиквитииилирования в клетках дрожжей.
4.1.2. Компоненты системы в клетках дрожжей
4.2. Деградация белков в вакуоли
4.2.1. Вакуоль
4.2.2. Некоторые белки, проходящие путь секреции, направляются в вакуоль на деградацию
4.2.3. Рецептор вакуолярного сортинга V способен направлять в вакуоль неправильно свернувшиеся белки л
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
. Штаммы микроорганизмов
1.1. Условия культивирования.
1.2. Штаммы бактерий . i.
1.2.1. Среды для выращивания . i.
1.3. Штаммы дрожжей
1.3.1. Среды для выращивания дрожжей.
2. Генетические методы
2.1. Трансформация дрожжей Я. i и . vii
2.2. Выделение и анализ ДНК клеток Я. .
2.3. Гибридизационный анализ дрожжевой ДНК.
3. Клонирование
3.1. Выделение плазмидной ДНК из . i.
3.2. Трансформация . i.
4. Методы работы с белками.
4.1. Тестирование ферментативной активности иРЛ
4.2. Индукция экспрессии иРА в штаммах Я. и . vii.
4.3. Измерение суммарного клеточного белка биурстовый метод
4.4. Электрофорез и иммуноблоттинг.
4.5. Анализ иРА из культуральной среды
4.6. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов
4.7. Определение количества иРА в препаратах культуральной среды дрожжевых лизатах с использованием иммуноблоттинга.
5. Получение антисыворотки против карбоксипсптндазы
6. Плазмиды
6.1. Место стыковки сигнальной последовательности с различными вариантами иРА РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Зависимость эффективности секреции иРА от уровня экспрессии в клетках II.
1.1. Зависимость продукции иРА от количества копий и места интеграции экспрессиоиной кассеты
1.2. Экспрессия иРА в клетках II. под контролем промотора гена I1.
2. Свойства секретнруемого и внутриклеточного иРА
3. Эффективность секреции иРА зависит от наличия в составе молекулы копцевых доменов и участка глнкознлнрования.
4. Низкая эффективность секреции иРА коррелирует с его агрегацией в путях секреции. уд
5. Экспрессия вариантов иРА с сигналом задержки в ЭР.
6. Влияние температуры инкубации при экспрессии иРА в клетках дрожжей II. .
7. Экспрессия иРА в дрожжах . vii
8. Мутации, приводящие к улучшению секреции иРА
8.1. Эффективность сортировки в вакуоль карбоксипептидазы в клетках мутантои, сверхсекретнруюших иРА
8.2. Нарушение рецептора V не увеличивает эффективность секреции иРА
8.3. Мутациярер4Л не влияет на эффективность секреции иРА
8.4. Агрегация иРА в мутантах, сверхсскретирующих иРА
8.4.1. Агрегация иРА и в клетках мутанта
8.4.2. Влияние мутаций ори и I на агрегацию иРА
8.4.2.1. Влияние мутации I на агрегацию .
8.4.2.2. Влияние мутации ори на агрегацию .
8.5. Экспрессия иРА под контролем промотора гена II в клетках сверхсекреторных мутантов.
8.6. Свойства секретнруемого и внутриклеточного иРА при экспрессии в клетках мутанта .
9. Влияние сверхсекреторных мутаций па чувствительность к дитиотрейтолу
9.1. Влияние мутации ге Н. ро1утогрш на чувствительность клеток к ДИТИОТреЙТОЛу
9.2. Влияние мутаций ртг1 и рт1 Н. ро1утогр1ш на чувствительность клеток к ДИТИОТреЙТОЛу.
ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Высокого уровня секреции иРА нельзя добиться путем увеличения уровня экспрессии
2. При высоком уровне экспрессии иРА накапливается внутриклеточно в виде агрегатов, формирующихся в ЭР.
3. Агрегация иРА не ингибирует секрецию иРА.
4. Домены молекулы иРА влияют на эффективность секреции этого белка клетками дрожжей
5. Накопление белка в ЭР мешает укладке новых молекул
6. Неправильно свернутый иРА может элиминироваться путем деградации
7. Вклад различных процессов, происходящих в ЭР, в эффективность секреции иРА.
7.1. Схема секреции иРА в дрожжах при низком уровне экспрессии этого белка.
7.2. Схема секреции иРА в дрожжах при высоком уровне экспрессии этого белка
8. Гликозилирование влияет на эффективность укладки иРА.
9. Возможные причины свсрхсекрсцни иРА.
9.1. Сверхсскреторныс мутации рпи1 и ори Н. ро1утогрИа.
9.2. Сверхсекрецня у мутантов с нарушенным балансом ионов кальция в секреторном пути
. Чувствительность сверхсекреторных мутантов к реагентам, провоцирующим образование нссвсриутых белков в ЭР.
. Секреция иРА клетками дрожжей сегешше.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Многие клеточные процессы являются консервативными, что делает знания, полученные в исследованиях дрожжевой клетки, приложимыми к описанию аналогичных процессов в клетках высших эукариот. Схожесть процессов синтеза и созревания белков делает дрожжи хорошим организмомхозяином для экспрессии гетсрологичных эукариотических генов. Путем экспрессии в дрожжах можно получать различные белки, используемые в промышленности, медицине и научных исследованиях. Стоит отметить, что многие процессы, происходящие в клетках различных эукариот, существенно дивергировали в ходе эволюции. Изучение процесса секреции белков высших эукариот в клетках дрожжей позволяет выявить особенности организации секреторного пути дрожжевой клетки. Однако результаты, полученные на одном модельном объекте, например на . Поэтому использование альтернативных модельных объектов позволяет понять, какие процессы в клетке эволюционно консервативны, а какие отражают особенности данного организма. Волее того, та или иная особенность нового модельного объекта может быть использована как эффективный инструмент исследования, который в большей степени подходит для решения конкретной экспериментальной задачи. В данной работе мы изучали особенности прохождения по дрожжевому пути секреции человеческого белка активатора плазминогеиа урокиназного типа иРА. Оказалось, что метилотрофные дрожжи имеют ряд преимуществ перед более традиционным модельным объектом . Именно использование Я. РА клегками дрожжей. Метилотрофные дрожжи II. Этот организм также давно привлекает исследователей, изучающих метаболизм метанола и функционирование пероксисом, а в последнее время все шире используется и в работах по изучению других процессов, например, глнкознлироваиия белков, ассимиляции нитрата и нитрита, регуляции генной экспрессии и др. И. ро1утогрЬа, что в существенной степени облегчает проведение молекулярногенетических исследований на этом объекте. ИЭК РКНПК М3 РФ на протяжении ряда лет проводятся исследования по изучению факторов, влияющих па секрецию различных чужеродных белков клетками дрожжей 5. II. Один из этих белков, иРА, неспособен эффективно секретироваться, что позволило получить мутации, увеличивающие эффективность секреции этого белка. Был клонирован ряд генов, в которых произошли эти мутации. Однако, оставалось невыясненным, какие именно механизмы препятствуют секреции иРА. Данная работа посвящена изучению факторов, определяющих низкую эффективность секреции иРА клетками дрожжей и механизмов, приводящих к ее увеличению в результате геномных мутаций. Человеческая клетка, в среднем, содержит ООО различных белков, клетка дрожжей около . Для нормального функционирования клетки каждый из этих белков должен оказаться в нужном компартменте или мембране компартмента. Направление новосинтезированных полипептидных цепей к месту назначения, так называемая сортировка белков i i необходимый процесс для компартментации и функционирования эукариотической клетки. При этом некоторые белки, кодируемые ДНК. Однако большинство митохондриальных белков и балков хлоропласт, а также все белки других органелл, кодируются ядерной ДНК. Для прохождения секреторного пути также используются сигналы сортировки новосинтезированная полипептидная цепь направляется в полость эндоплазматического ретикулума ЭР, далее попалает в аппарат Гольджи. Рисунок 1. Секреторный путь в эукариотических клетках. Все ядерные мРНК транслируются на цитозольных рибосомах. Рибосомы, синтезирующие секреторные белки направляются к шероховатому ЭР, благодаря наличию сигнальной последовательности. Стоит отмстить, что белками секреторного пути являются не только те, которые в конечном итоге секретируются, но и ферменты и белки, которые постоянно присутствуют в полости ЭР, аппарате Гольджи, лизосомах, а также белки, ннтщрированные в мембраны этих органелл или плазматическую мембрану. Данный обзор будет посвящен описанию организации секреторного пути и механизмов, при помощи которых секреторные белки клеток дрожжей и млекопитающих сортируются по клеточным комиартменгам. Особое внимание будет уделено созреванию модифицированию белка и прохождению им системы контроля качества.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.668, запросов: 145