Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых простагландин-Н-синтазой

Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых простагландин-Н-синтазой

Автор: Цаплина, Людмила Александровна

Год защиты: 2007

Место защиты: Москва

Количество страниц: 177 с. ил.

Артикул: 3342005

Автор: Цаплина, Людмила Александровна

Шифр специальности: 03.00.02

Научная степень: Кандидатская

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Место РвНв в цепи синтеза простагландинов.
2. Структура РвНВ
2.1 Доменная структура Рв1В.
2.2 Структура циклооксигеназного и пероксидазного активных центров
3. Каталитические свойства РвШ циклооксигеназная и пероксидазная реакции
4. Механизм циклооксигеназной реакции РИК
4.1 Циклооксигеназная реакция
4.2 Роль торозилрадикала в осущесвлении циклооксигеназной реакции РВ
4.3 Связывание арахидоновой кислоты в циклооксигеназном активном центре.
4.4 Молекулярный кислород как субстрат циклооксигеназной реакции
5. Механизм пероксидазной реакции РСНБ.
6. Кинетические особенности действия РвШ и схемы, предложенные для описания этих особенностей.
7. Влияние различных ингибиторов на циклооксигсназную активность фермента РвШ.
7.1 Селективные ингибиторы по отношению к изоформам РвНВ
7.2 Механизмы действия ингибиторов РвШ.
7.3 Структурные различия циклооксигеназного активного центра РвШ и 2, влияющие на механизмы их ингибирования.
7.4 Создание новых специфичных ингибиторов РОНБ2 путем биохимических преобразований ЫБАГОэ.
7.5 Недостатки использования специфичных ингибиторов РОНБ2. Сердечнососудистые заболевания.
8. Инактивация РвШ
8.1 Инактивация РйНБ в процессе
реакции.
8.2 Кинетические механизмы, предлагаемые для описания инактивации РСНБ
9. Бифункциональные ферменты
. Многосубстратные ферментативные реакции.
. Инактивация ферментативных реакций
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
2. Методы.
2.1 Получение РвНБ
2.2 Очистка РвНБ
2.3 Определение белка.
2.4 Электрофорез в полиакриаламидном геле.
2.5 Определение активностей РвНБ
2.5.1 Определение циклооксигеназной активности
2.5.2 Определение пероксидазной активности
2.5.3 Определение суммарной активности РОНБ.
2.5.4 Определение каталазной активности.
2.5.5 Определение циклооксигеназной активности РвНБ при различных значениях
2.5.6 Ингибирование циклооксигеназной активности напроксеном.
2.5.7 Обработка кинетических кривых
2.6 Определение активностей РвНБ в ходе протекания альтернативной
реакции
2.6.1 Циклооксигеназная активность фермента РвНБ, инкубированного
в условиях протекания пероксидазной реакции
2.6.2 Пероксидазная активность фермента РОНБ, инкубированного в условиях протекания циклооксигеназной реакции
2.7 Определение активностей РвШ при прединкубации фермента с перекисью водорода.
2.7.1 Определение циклооксигеназной активности.
2.7.2 Определение пероксидазной активности.
2.8 Обработка экспериментальных данных по инактивации РвШ
2.9 Определение циклооксигеназной активности РСШ в присутствии экзогенно добавленных гемина, сульфата аммония и додецилсульфата натрия.
2. Квантовохимические расчеты.
3. Приготовление растворов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Теоретическое исследование кинетических закономерностей ферментативных реакций.
1. Разработка теоретических моделей
1.1 Обобщенная модель неразветвленной ферментативной реакции, сопровождающейся инактивацией фермента в процессе реакции
I.2. Кинетические закономерности взаимного влияния двух реакций, катализируемых бифункциональным ферментом
II. Экспериментальное исследование кинетических закономерностей фермента РвШ.
2. Очистка РвНБ методом колоночной хроматографии.
3. Исследование взаимного влияния циклооксигеназной и пероксидазной реакций фермента РвШ.
3.1 Влияние доноров электронов, субстратов пероксидазной реакции,
на циклооксигеназную реакцию РвНБ.
3.2 Влияние перекиси водорода, субстрата пероксидазной реакции, на циклооксигеназную реакцию РОНБ.
3.3 Влияние напроксена, ингибитора циклооксигеназной реакции РвШ, на циклооксигеназную и пероксидазную реакции
3.4 Влияние арахидоновой кислоты, субстрата циклооксигеназной реакции РОШ, на пероксидазную реакцию
3.5 Влияние напроксена, ингибитора циклооксигеназной реакции РвНБ, на суммарную реакцию.
4. Кинетическая модель действия РйШ.
4.1 Требования к кинетической модели действия РвШ.
4.2 Предполагаемая схема действия РОШ.
4.3 Вывод уравнения зависимости начальной скорости
циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты и
донора электронов ТМРО
4.4 Обсуждение результатов исследования взаимовлияния реакций
5. Инактивация циклооксигеназной и пероксидазной реакций РОНБ в процессе катализа.
5.1 Влияние времени инкубации фермента РОНБ в условиях
протекания циклооксигеназной реакции в отсутствие донора электронов на пероксидазную и циклооксигеназную активности
5.2 Влияние времени инкубации фермента РвШ в условиях
протекания циклооксигеназной реакции в присутствии донора электронов на пероксидазную и циклооксигеназную активности
5.3 Влияние времени инкубации фермента РвНв в условиях
протекания пероксидазной реакции на циклооксигеназную и
пероксидазную активности
6. Кинетическая модель инактивации циклооксигеназной и
пероксидазной активностей РОШ в процессе протекания
катализируемых им реакций
7. Прединкубация с перекисями
7.1 Влияние времени прединкубации фермента РвШ с перекисью водорода и третбутилпероксида на пероксидазную и циклооксигеназную активности
7.2 Влияние прединкубации фермента РвШ с различными
концентрациями перекиси водорода на пероксидазную активность
7.3 Влияние прединкубации фермента РвШ с различными
концентрациями перекиси водорода на циклооксигеназную активность
7.4 Влияние прединкубации фермента РвШ с различными
концентрациями третбутилпероксида на пероксидазную активность
7.5 Влияние прединкубации фермента РвШ с различными
концентрациями третбутилпероксида на циклооксигеназную активность
8. Кинетическая модель инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвШ при прединкубации с перекисью водорода
9. Обсуждение результатов исследования инактивации РвШ. Возможные молекулярные механизмы инактивации
9.1 Обсуждение результатов исследования инактивации РСНБ
9.2 Возможный молекулярный механизм химизм инактивации циклооксигеназной реакции.
9.3 Возможный молекулярный механизм химизм инактивации пероксидазной реакции.
. Зависимость кинетических характеристик циклооксигеназной активности РвГО от значения
. Влияние гемина, сульфата аммония и додецилсульфата натрия на кинетику инактивации фермента РОНБ в процессе циклооксигеназной
реакции
.1 Влияние гемина на кинетику инактивации фермента РСНБ в процессе циклооксигеназной реакции.
.2 Влияние сульфата аммония на кинетику инактивации фермента РвШ в процессе циклооксигеназной реакции.
.3 Влияние додецилсульфата натрия на кинетику инактивации
фермента РвШ в процессе циклооксигеназной реакции
. Квантовохимический расчет геометрии арахидоновой кислоты и
простагландинов в2 и Н2
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


За открытие механизма действия аспирина в году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. С тех пор интерес к изучению простагландинов лишь усилился. Это связано с исключительно важной ролью, которую играют простагландины и родственные им соединения тромбоксаны и простациклины в развитии воспалительных процессов, повышения температуры, аллергических реакций ,, иммунного ответа 8,, в свертывании крови ,, показано их участие в возниновении раковых опухолей , и болезни Альцгеймера . Кроме того, они служат медиаторами боли ,, поэтому регуляция их синтеза актуальная на сегодня задача медицины. Простагландины и родственные им соединения тромбоксаны представляют собой продукты окисления полиненасыщенных жирных кислот. В зависимости от субстрата конечные продукты биосинтеза простагландинов и тромбоксанов обозначаются цифровыми индексами, которые соответствуют числу двойных связей в молекуле продукта. Соединения, образующиеся в результате ферментативного превращения арахидоновой кислоты, отмечаются индексом 2 например РОЕ2, Рв в отличие от производных цис8,,эйкозатриеновой 3 индекс 1 и цис5,8,,,эйкозапентаеновой 5 индекс 3 кислот. Буквенные обозначения Н, Е, И соответствуют характеру заместителей в молекуле продуктов, который определяется специфичностью производящих их ферментативных систем . РвНБ может преобразовывать 3, 4, 5 в соответствующие простагландины с разной степенью эффективности 5 . Схема биоспсцифического окисления жирных кислот полиферментативной системой синтеза простагландинов на примере арахидоновой кислоты показана на схеме 1 . РвН2 в конечные продукты, катализируемое органоспецифическими ферментами РвНконвертазами . Далее простагландин Н2 под действием специфических конвертаз может превращаться в физиологически активные соединения, такие как простагландины Е2, Э2, Р2, тромбоксан А2, простациклин. Таким образом, РвШ является центральным звеном цепи синтеза внутриклеточных регуляторов простагландинов, обеспечивающим все последующие стадии универсальным строительным материалом простагландином Н2. Схема 1. Схема биоспецифического синтеза простагландинов и тромбоксанов. Структура РНБ. Ферментативные системы, конвертирующие жирные кислоты в прстагландины, содержатся во всех обследованных органах и тканях , за исключением лейкоцитов . РСНБ, причм основные свойства этого фермента из желз барана и быка одинаковы 9,. РОНЭ мембранносвязанный гликопротеин, активные центры которого находятся на поверхности эндоплазматической сети, граничащей с цитоплазмой. В раствор этот фермент переходит в присутствии неионного детергента наиболее часто применяют твин 9,,,. В 0,1 растворе твина фермент связан с детергентом в соотношении , по массе 9. Данные гельхроматографии 9, и электрофореза в полиакриламидном геле 9 дают основания считать, что фермент РвШ в растворе присутствует в виде димера, состоящего из двух одинаковых субъединиц с молекулярным весом кДа . На основании изучения спектров абсорбции гемовой группы РвШ было установлено, что каждая субъединица апофермента РСШ связывает одну молекулу гемина и осуществляет циклооксигеназный и пероксидазный катализ в комплексе с ним ,. Связывание гемина строго необходимо для проявления каталитических активностей фермента 9,,, и, повидимому, существенно изменяет конформацию белка, так как неустойчивый к обработке трипсином апофермент полностью сохраняется в присутствии гемина в концентрации, достаточной для образования холофермента . Равновесная константа связывания РСШ с гемином по данным работы равна 0, М1. Кинетические и кристаллографические исследования показали, что циклооксигеназный и пероксидазный активные центры в субъединице РвШ пространственно разнесены и расположены по обе стороны от плоскости гемовой группы . У млекопитающих простагландинНсинтаза постоянно присутствует в клетках, обеспечивая их нормальное функционирование , эта изоформа получила название РСШ1. Другая изоформа РОШ2 нарабатывается в ответ на определенные стимулы, такие как цитокины или факторы роста . В настоящей работе исследовались свойства РСН из везикулярных желез семенных пузырьков барана.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.311, запросов: 145