Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических субстратов. Дизайн биосенсоров

Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических субстратов. Дизайн биосенсоров

Автор: Иванова, Екатерина Владимировна

Шифр специальности: 02.00.15

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2003

Место защиты: Москва

Количество страниц: 149 с. ил

Артикул: 3295651

Автор: Иванова, Екатерина Владимировна

Стоимость: 250 руб.

Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических субстратов. Дизайн биосенсоров  Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических субстратов. Дизайн биосенсоров 

Введение.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1.Обзор литературы
1.1. Хиноферменты.
1.1.2. Свойства Рббзависимой глюкозодегидрогеназы
1.1.3. Роль профиль,катализируемого 2глюкозодегидрогеназой окисления глюкозы
1.1.4. Термостабильность
1.1.5. Строение активного центра раевторимой Рб6зависимой
глюкозодегидрогеназы
1.1.5.1. Центры связывания кальция
1.1.5.2. Центр связывания .
1.1.5.3. Центр связывания Хглюкозы.
1.1.6. Строение активного центра мембранной глюкозодегидрогеназы
1.1.7. Механизм окисления Хглюкозы растворимой
Рбзависимой глюкозодегидрогеназой.
1.2. Глюкозооксидаза структура, свойства, механизм
действия
1.2.1. Глюкозооксидаза как окислитель глюкозы.
1.2.2. Источники
1.2.3. Строение.
1.2.4. Строение активного центра глюкозооксидазы
1.2.5. Свойства глюкозооксидазы.
1.2.5.1. Стабильность
1.2.6. Ингибиторы.
1.2.7. Восстанавливающие субстраты
1.2.8. Окисляющие субстраты глюкозооксидазы.
1.2.9. Другие окисляющие субстраты
глюкозооксидазы.
1.2 Механизм реакции
1.2 профиль реакции окисления Оглюкозы,
катализируемой глюкозооксидазо
1.3. Сравнтельный анализ глюкозооксидазы и Рзависимой
глюкозодегидрогеназы
1.4. Амперометрические биосенсоры.
1.4.1. Метод циклической вольтамперометрии.
Оценка свойств искусственных переносчиков электронов
1.4.2. Искусственные переносчики электронов.
1.4.3. Теория переноса электрона Маркуса
1.4.4. Способы иммобилизации фермента.
1.4.5. Конфигурация медиаторных биосенсоров.
1.5. Электронный перенос в белках.
1.6. Предварительные выводы и постановка задачи диссертационного исследования.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реагенты.
2.2. Оборудование.
2.2.1. Спектрофотометрические измерения.
2.2.2. Электрохимические измерения
2.2.3. Измерение времени стабильности биосенсоров.
2.3. Приготовление растворов
2.3.1.Приготовление растворов Оглюкозы.
2.3.2. Приготовление растворов ферментов
2.3.3. Приготовление растворов комплексов рутенияН
2.3.4. Приготовление растворов комплексов рутсш1яШ
2.4. Сравнительное изучение кинетики каташгзируемого ФАДзависимой глюкозооксидазой и зависимой глюкозодегидрогеназой окисления 9глюкозы в присутствии соединений рутенияШ
2.4.1. Определение стехиометрии реакции окисления Оглюкозы соединениями рутенияШ
2.4.2. Кинетические измерения.
2.4.3. Определение вида зависимости скорости окисления глюкозы соединениями рутенияШ от концентрации катализирующего фермента.
2.4.4. Определение вида зависимости скорости окисления Оглюкозы соединениями
рутенияШ в присутствии ГО или ГДГ от концентрации субстратов
2.5. Исследование свойств медиаторов в безреантных амперомегрических биосенсорах.
2.5.1. Приготовление углеродной пасты.
2.5.2. Включение комплексов рутения в углеродную пасту
2.5.3. Приготовление электродов из углеродной пасты, обогащенных
комплексами рутения.
2.5.4. Приготовление биосенсора типа А.
2.5.5. Приготовление биосенсора типа В.
2.5.6. Приготовление биосенсора типа С.
2.5.7 Хроноамиерометрическос тестирование биосенсоров.
2.6. Ьезреагентные сенсоры для определения глицерина созданные на основе, содержащих рутениевые медиаторы, электродов из углеродной пасты
2.6.1. Исследование электрохимических свойств иммобилизованных соединений рутения методом циклических вольтамперограмм
2.6.2. Исследование реакционной способности иммобилизованных соединений рутения в реакции электрохимического окисления НАДН.
2.6.3. Дизайн глицеринового биосенсора
2.6.4. Хроноамперометрическое тестирование глицериновых сенсоров
2.6.5. Определение времени стабильности электрода.
2.7. Исследование стрсоспецифичности оксидоредуктаз к конфигурации металлического центра на примере и оптических изомеров , где 2фенилпиридин, 2,2,бипиридии или 1, фенантролин.
2.7.1. Разделение стереоизомеров 2, где 4 фенилпиридин, 2,2бипиридин и 1,фенантролин.
2.7.2. Исследование стерсосслсктивности окисления оптических стсрсоизомеров , где 4 фенилпиридин, 2,2 бипиридин и 1,фенантролин пероксидом водорода в присутствии иероксидазы из корней хрена.
2.7.3. Электрохимическое исследование сгереоселективности окисления восстановленного активного центра ГО или ГДГ соединениями рутенияШ.
2.7.4. Спектрофотометрическос исследование стсрсоселективности соединений рутенияШ в реакции окисления глюкозы катализируемого ГО
2.8. Исследование реакционной способности облученных комплексов рутения в системах медиатор глюкоза ГО.
2.8.1. Фотолиз комплексов
2.8.2. Спектрофотометрические исследования
2.8.3. Циклические реакции системы облученный рутений глюкоза ГО
кислород.
2.8.4. Влияние концентрации рутения на кинетику восстановления облученных комлексов рутенияОглюкозой в присутствии ГО.
2.8.5. Исследование электрохимического поведения фотоактивированного комплексов
рутения в системе ГО Лглюкоза рутений
2.9. Исследование электрохимии системы ОГДГ глюкоза рутений
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Сравнительное изучение кинетики катализируемого ФАДзависимой глюкозооксидазой и РОзависимой глюкозодегидрогеназой окисления глюкозы соединениями рутенияШ.
3.1.1. Стехиометрия окисления Оглюкозы комплексами рутенияШ в присутствии ГО или ГДГ
3.1.2. Кинетика катализируемого ГО окисления глюкозы комплексами рутенияШ.
3.1.3 Влияние зависимой ГДГ на скорость восстановления ЯиЦИ под действием
глюкозы.
3.1.4. Взаимовлияние субстратов глюкозодегидрогеназы на скорость окисления глюкозы соединениями рутснияШ
3.1.5. рНпрофиль реакции окисления Зглюкозы соединениями рутенияШ, катализируемой ГО или ГДГ.
3.1.6. Сравнительный анализ каталитических свойств глюкозооксидазы и глюкозодегидрогеназы в реакции восстановления соединений рутенияШ
глюкозой
3.2. Исследование свойств медиаторов в безреагентных амперометрических биосенсорах, на основе комплексов рутения общей формулы ШХ2Х2, где IX 1,фенантролин или 4,4замешенный 2,2бипиридин, а X ацидолиганд
3.2.1. Конфигурация биосснсора для быстрого тестирования свойств медиатора.
3.2.2. Тестирование полученных биосенсоров.
3.2.3. Опсративнная стабильность электродов
3.3. Безреагентные сенсоры для определения глицерина созданные на основе, электродов из углеродной насты, содержащих рутениевые медиаторы
3.3.1. Исследование электрохимических свойств электродов из углеродной пасты, обогащенной комплексами рутения.
3.3.2. Дизайн биоссисоров.
3.3.3. Термодинамические вольтамперограммы
3.3.4. Хроноамперометрические исследования биоссисоров на основе углеродной пасты, обогащенноой соединениями рутения, модифицированных НАД зависимой пшцериндегидрогеназой.
3.3.5. Хроноамперометрические исследования биосенсоров на основе углеродной пасты, обогащенной соединениями рутения, модифицированных зависимой глицериндегидрогеназой.
3.3.6. Стабильность электродов.
3.4. Исследование стереоснецифичности оксидоредуктаз к конфигурации металлического центра на примере и оптических изомеров ЯирЬруЬЬ2РРб, где рИру 2фенилпиридии, а IX 2,2бипиридин или 1, фенантролин. Тонкие ферментсубстратные взаимодействия.
3.4.1. Выделение и характеристика стереоизомеров КирЬру1Х2РРб
3.4.2. Кинетические исследования
Исследование стереоселективности узнавания стсреоизомеров рутениевого комплекса восстановленной формой ГОГДГ
3.4.3. Влияние на стереоселективность окисления октаэдрических изомеров рутения И пероксидом водорода в присутствии ИХ.
3.4.4. Влияние на стереоселективность восстановления стереоизомеров рутения III глюкозой в присутствии ГО.
3.4.5. Чувствительность глюкозооксидазы к И и Эизомерии
3.5. Циклические реакции в системе облученный рутениевый комплекс Оглюкоза
3.5.1. Фотоокисление комплекса рутения.
3.5.2. Взаимодействия в системе облученный Яи глюкоза ГО
3.5.3. Циклические реакции в системе фотооблученный Яи глюкозаГО кислород
3.5.4. Электрохимическое поведение системы облученный И иглюкозаГО
3.5.5. Циклические реакции в системе облученный и 1глюкозаГО.
Электрохимическое исследование.
3.6. Электрохимия системы ЯиП0глюкоза зависимая ГДГ
3.6.1. Исследования электрохимии системы ГДГ Оглюкоза ГО
3.6.2. Связывание фотоактивированного рутения с ГДГ
3.7. Резюме
Приложение 1. Структурные формулы и сокращения некоторых окисляющих
глюкозооксидазу субстратов.
Приложение 2. Строение рутениевых соединений.
Приложение 3. Вывод уравнения 3.1.4.
Приложение 4. Вывод формулы 3.1.5.1
ВВЕДЕНИЕ


Поэтому, целью данной работы являлось разработки для создания безреагентных амперометрических биосенсоров не чувствительных к присутствию кислорода, для чего в данном исследовании было реализован подход, основанный на использовании кислороднезависимых ферментов. Такими ферментами являются хинобелки , и НАДзависимые дегидрогеназы. НАДзависимых ферментов ограничено изза того, что для их функционирования требуется присутствие растворимого кофактора, в то время как хинобелки используют связанный кофактор, и способны переносить электрон на искусственные акцепторы электронов, отличные от кислорода,, поэтому поиск искуственных субстратов для хиноферментов является важной задачей. В рамках данного исследования планировалось провести сравнительный кинетический анализ окисления Оглюкозы соединениями рутения в присутствии двух различных биокатализаторов глюкозоокидазы и 0зависимой глюкозодегидрогеназы. Поиск искусственных субстратов велся среди координационных соединений рутения, и рутенациклических соединений, обладающих фрагментом связи рутенийуглерод, придающей жесткость структуре комплекса, и потому позволяющей надеяться на высокие значения констант самообменадля этих соединений. На основе электродов из углеродной пасты были созданы прототипы биосенсоров на основе соединений рутения, позволяющие детектировать концентрации Пглюкозы, спирта и глицерина, с использованием как коммерчески доступных НАД зависимых ферментов, гак и недавно выделенных хинобелков, катализирующих сходные реакции. Исследования поведения фотоактивированных соединений с фотолабильными лигандами в системах фотоактивированный рутенийЛглюкоза глюкозооксидаза и фотоактивированный рутенийОглюкоза0зависимая глюкозодегидрогеназа интересно с точки зрения создания медиаторов нового типа. Введение рутениевой метки в молекулу биокатализатора переводит реакцию переноса электрона во внутримолекулярный режим, значительно укорачивает дистанцию переноса электрона, происходит значительно эффективней внешнемолекулярного переноса электрона. Исследование участия химически модифицированных ферментов в катализе важно, как для понимания механизма переноса электрона в белках, так и для решения практических задач, связанных с разработкой и усовершенствованием амперомстрических биосенсоров. Хиноферменты. Первое упоминание хинобелков в литературе относится к году, и история их исследования начинается с характеристики новой простетической группы, обнаруженной Хаугом в метанолдегидрогеназе, содержащей хиноструктуру и два атома азота ,. Сам термин хинобелки вводится позднее Дунном и объединяет все белки, содержащие пирролохинолинхиноновую Рб простетическую группу. Структура Р2 представлена на схеме 1. Окислительновосстановительный потенциал простетической группы 0, В. Это выше чем у ФАДа 0,0 В и НАД 0, В, но ниже чем у геминового железа 0,5 В , что определяет положение хиноферментов среди оксидоредуктаз. РО это не единственная простетическая группа, встречающаяся у объединенных в хиноферменты белков. Схема 1. Кофакторы хиноферментов . Наряду с Р, редокс состояние белка могут определять следующие группы топахинон , тринтофантринтофилхинон 7Т0 3 и лизинтирозилхиион 2 Схема 1. Принято считать, что сингезируется микроорганизмом из тирозина и глутаминовой кислоты ,3. Хиноферменты могут быть разделены по крайней мере но трем критериям отличия в строении кофактора, наличие дополнительных связанных редокс групп и нахождение в клетке. Кофакторы, встречающиеся в хинобелках представлены на схеме 1. По нахождению в клетке различают растворимые и мембранные дегидрогеназы. Растворимые белки катализируют реакции в цитоплазме. Мембранные белки, находятся в мембране. Отличия в строении растворимых и мембранных дегидрогеназ связаны с наличием терм инального гидрофобного тране. Ферменты, имеющие Р в активном центре, как правило, ферменты бактериального происхождения , из которых наиболее известны белки, катализирующие окисление спиртов и глюкозы в периплазме бактерий рис. Рис. РЙзавнсимой глюкозодегидрогеназы из . Рзависимая глюкозодегидрогеназа из ii . Аналогично зависимая глюкозодегидрогеназа из .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.188, запросов: 121