Взаимодействие апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека с ДНК-интермедиатами и белками репарации и репликации

Взаимодействие апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека с ДНК-интермедиатами и белками репарации и репликации

Автор: Дырхеева, Надежда Сергеевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 141 с. ил.

Артикул: 4478703

Автор: Дырхеева, Надежда Сергеевна

Стоимость: 250 руб.

Взаимодействие апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека с ДНК-интермедиатами и белками репарации и репликации  Взаимодействие апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека с ДНК-интермедиатами и белками репарации и репликации 

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Общие свойства апурнновойапнримндиновой эндонуклеазы 1 человека 9
1.2. Синтез АРЕ1 в клетке. АРЕ1 как окислительновосстановительный фактор
СЯеМ
1.3. Участие АРЕ1 в эксцизнонной репарации основании ДНК
1.3.1. Этапы эксцизиоиной репарации оснований
1.3.2. Зфосфатазная и Зфосфодиэстеразная активности
1.3.3. Взаимодействие ЛРЕ1 с белками ЭРО
1.3.4. ДНКсвязывающая, эндонуклеазная и экзонуклеазная активности
АРЕ1. Особенности механизма эндонуклеазнойреакции АРЕ1
1.4. экзоиуклеазная активность АРЕ1
1.4.1. Удачение неспаренных и модифицированных нуклеотидов с Зконца
1.4.2. Влияние типа ДНКдупчекса на экзонуклеазную активность АРЕ1
1.4.3. Экзонуклеазная активность АРЕ1 в зависимости от
структурных особенностей 5 конца олигонуклеотида
1.4.4. Влияние условий реакции на экзонуклеазную и эндонуклеазную
активности АРЕ1
1.5. Инцизионная репарация нуклеотидов ДНК
1.6. Участие АРЕ1 в апонтозе и других процессах
1.7. Роль АРЕ1 в развитии заболеваний
1.7.1. Уровень АРЕ1 при различных заболеваниях
1.7.2. Терапия
Заключение к главе 1
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Ферменты, антитела, бактериальный штамм, плазмиднаяДНК
и клеточный экстракт
2.1.3. Нуклеотиды, радиоактивномеченые соединения и олигонуклеотиды
2.2. Методы исследования
2.2.1. Гельэлектрофорез в ПААГ нуклеиновых кислот и белков
2.2.2. Выделение и очистка рекомбинантной апуриновойапирамидиновой эндонуклеазы
1 человека, экспрессированной в клетках .i
2.2.3. Включение Рметки в 5конец олигонуклеотида, очистка олигонуклеотидов и
Формирование ЛНКдуплексов
2.2.4. Создание ДНКструктур, содержащих , морфопидаты или
фотоактивируемые аначоги У на 3конце праймера
2.2.5. Лигирование одноцепочечного разрыва с фотоактивным аналогом дЕМР на 3
2.2.6. Встраивание в 3конец одноцепочечного разрыва природного после
фотоаналога с помощью 3полимеразы
2.2.7. Синтез ЛИК. катализируемый Рполимеразой на ДНКгес
2.2.8. Эндонуклеазная активность АРЕ1
2.2.9. Экзонуклеазная активность АРЕ1
2.2 Экзонуклеазная активность АРЕI в обращенных мицеллах
2.2 Реакция фотоаффинной модификации
2.2 Определение концентрации АРЕ1 и Рполимеразы в МЕЕэкстракте с помощью иммуноблоттинга
2.2 Определение стабильности комплексов ДНКдуплексов с АРЕ1, 1полимеразой иили ЯРА методом задержки в геле
2.2 Определение стабильности ДНКдуплексов методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала
2.2 Трипсин ото АРЕ1
2.2 Флуоресцентный анализ термической денатурации АРЕ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение и очистка АРЕ
3.2. экзонуклсазная активность АРЕ
3.2.1. Экзонуклеазное выщепление природных нуклеотидов
3.2.2. Фотоактивируемые аналоги как модели природных 1ЫМР в составе канонической или неканонической пары
3.2.3. Выщепление с 3конца праймера аналогов ШМР, модифицированных по рибозе
3.2.4. Зависимость экзонуклеазной активности АРЕ1 от типа ДНКдуплекса и структурных особенностей Зконца олигонуклеотида, фланкирующего одноцепочечный разрыв
3.2.5. Влияние условий реакции на эндонуклеазную и экзонуклеазную активности АРЕ
3.2.6. 3 5экзонуклеазная активность А РЕ1 и стабильность ДНКдуплекса
3.3. Взаимодействие АРЕ1 с ДНК и хфугими белками
3.3.1. Фотоаффинная модификация рекомбинантных белков А РЕ1 и 1полимеразы
3.3.2. Фотоаффинная модификация АРЕ 1 и Рполимеразы при совместном присутствии очищенных белков и в клеточном экстракте
3.3.3. Связывание АРЕ 1 с различными олигонуклеотидпыми структурами
3.3.4. Взаимодействие АРЕ1 с рполимеразой, ЯРА иХЯСС
Заключение к главе
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
дидезоксирибонуклеозид5трифосфат ЭРО эксцизионная репарация оснований ДНК ИРН инцизионная репарация нуклеотидов ДНК АРсайт апуриновыйапиримидиновый сайт ДНК АРэндонуклсаза апурииоваяапиримидиновая эндонуклеаза АРЕ1 апурииоваяапиримидиновая эндонуклеаза 1 человека полимераза, ДНКполимераза 1 флэпэндонуклеаза
1 человеческий гомолог эндонуклеазы III . i
I 8оксогуанинДНКгликозилаза
1 полиАОРрибозополимераза
ядерный антиген пролиферирующих клеток
репликативный фактор С
репликативный белок А
Торо I ДНКтопоизомераза I
X1 белок, входящий в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению
Тетрагидрофуран, Згидрокси2гидроксиметилтетрагидрофуран АРДНК ДНК с АРсайтом ДНК ДНК с тстрагидрофураном
группа на 5конце олигонуклеотида, содержащая остаток тетрагидрофуранофосфага ОН гидроксильная группа р фосфатная группа дезоксирибозофосфатная группа дцДНК двухцепочечная ДНК оцДНК одноцепочечная ДНК оцразрыв разрыв в одной из цепей ДНК н, пн нуклеотидов, пар нуклеотидов нт нуклеотидное звено
экзоЫазидо2,3,5,6тетрафторбензилиденаминооксиметилкарбамилэтил 2дезоксицитидин5трифосфат
РАВСТРэкзоК4азидотетрафторбензилиденгидразинокарбонил
бутилкарбамоил2дезоксицитидин5трифосфат
экзоЫазидо2,3,5,6тетрафторбензилиденаминооксибутилокси2дезоксирибоцитидин5трифосфат
РАРбСТРэкзоК2р4азидо2,5дифтор3хлорпиридин6ил
аминопропиониламиноэтил2дезоксицитидин5фифосат
УФсвет ультрафиолетовый свет
МгидроксиэтшОмиперазинМэтансульфоновая кислота
нонидет Р
фенилметилсульфонилфторид
додецилсульфат натрия
i трисгидроксиметиламинометан
БСА бычий сывороточный альбумин
ПААГ полиакриламидный гель
ТЕМЕД ДЧ,Л,Ртетраметилэтилендиамин
ЭДТА этилендиаминтстрауксусная кислота
ВВЕДЕНИЕ


Консервативные аминокислоты, необходимые для нуклеазной активности, расположены в активном центре и в центре связывания двухвалентного иона металла . Было показано, что а,рсэндвичструктура также встречается у фосфатаз и белков, участвующих в регуляции клеточного цикла и сигнальной трансдукции . Да отвечает за окислительновосстановительную функцию АРЕ1 1, независимую от репаративных функций этого фермента. В структуре ЕхоШ отсутствует подобный концевой гибкий домен аминокислотных остатков . Синтез АРЕ1 в клетке. В клетках человека АРЕ1 синтезируется в большом количестве. В зависимости от типа клеток, АРЕ1 локализуется преимущественно в ядре 7, , , цитоплазме или в митохондриях , . Было предположено, что повышенное содержание этого белка в цитоплазме может быть обусловлено ассоциацией с мембраной ЭПР, при этом окислительновосстановительная функция АРЕ1 необходима для образования восстановленной формы синтезируемых белковфакторов транскрипции, чтобы обеспечить их проникновение в ядро клетки . ЛРЕ1, без Иконцевого участка состоящего из х аминокислотных остатков, который содержит сигнал ядерной локализации . Было показано , что инактивация на АРЕ1 на ранних стадиях эмбриогенеза легальна для мышей. В культуре клеток человека этот белок также необходим для обеспечения их жизнеспособности , . В экстракте клеток НеЬа активность АРЕ1 составляет от суммарной активности по расщеплению АРсайтов . Вторая АРэндонуклеаза человека АРЕ2 также принадлежит к семейству ЕхоШ, но уровень ее эндонуклеазной активности существенно ниже, чем у АРЕ1 . Уровень экспрессии гена, кодирующего АРЕ1, повышается при окислительном стрессе. Таким образом, этот фермент, очевидно, является . В то же время, не всегда ясно, чем обусловлено такое участие репаративной функцией АРЕ1 или активностью фермента как регулятора транскрипции . Таблица. Как окислительновосстановительный фактор 1, АРЕ1 выступает в роли регулятора экспрессии генов табл. В, активирующий белок 1 АР1 , , . ДНК и активировать транскрипцию целевых промоторов р, а также участвует в регуляции проапоптотичсских функций белка р . ДНКсвязывающей активности путем восстановления остатков цистеина. Существенную роль в структуре АРЕ для проявления 1 активности играет аминокислотный остаток в восстановленной форме. В окисленной форме предположительно образует дисульфидный мостик с 5, . Методом сайтнаправленного мутагенеза было показано, что замена остатка на аланин влияет на 1 активность и не отражается на эффективности ДНКсвязывающей, эндонуклеазной и экзонуклеазной активностей АРЕ1 . В литературе в основном подчеркивается необходимая роль репарационных функции АРЕ1 для жизнедеятельности клеток млекопитающих. Однако, попытки восстановить репарацию НК в клетках без АРЕ1, используя дрожжевой гомолог , который не имеет концевого домена, отвечающего за окислительновосстановительную 1 функцию, или используя мутанты АРЕ1 без сайтов ацетилировання, но с репарационной функцией, или мутант без 1 функции, полностью не восстанавливают жизнеспособность клеток . С помощью специфичного ингибирования 1 функции было показано, что развитие гемангиобластов i vi значительно ухудшалось. По приведенным данным сделан вывод, что репарационная функция критична для выживания, 1 функция для роста клеток . Высказана гипотеза о том, что окислительновосстановительная функция АРЕ регулируется протеинкиназой С РКС, осуществляющей фосфорилирование сайтов, расположенных в обоих функциональных доменах белка . Клетки лейкемии человека на совокупное действие окислительного агента пшохлорита и метилмстансульфоната отвечают повышением активности РКС с соответствующим повышением уровня фосфорилирования АРЕ . Это приводит, в свою очередь, к росту окислительновосстановительной активности 1. Эти воздействия не приводят к увеличению количества I в клетке и не влияют на ее рспаративную активность. Результаты, полученные в данной работе, позволяют предположить, что способность АРЕ1 выполнять функцию 1 зависит от уровня фосфорилирования белка с помощью РКС, которое происходит в ответ на действие ДНКповрсждающих агентов.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.220, запросов: 121