Молекулярное окружение IRES-элемента РНК вируса гепатита C на 40S субчастице рибосомы человека

Молекулярное окружение IRES-элемента РНК вируса гепатита C на 40S субчастице рибосомы человека

Автор: Бабайлова, Елена Сергеевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 133 с. ил.

Артикул: 4343616

Автор: Бабайлова, Елена Сергеевна

Стоимость: 250 руб.

Молекулярное окружение IRES-элемента РНК вируса гепатита C на 40S субчастице рибосомы человека  Молекулярное окружение IRES-элемента РНК вируса гепатита C на 40S субчастице рибосомы человека 

1.1. Структу ра I
1.1.1. Структу ра домена II
1.1.2. Структура домена III.
1.1.3. Структура соединения ШаЬс.
1.2. Стадии Iзависимой инициации трансляции РНК ГС и факторы необходимые для этого процесса.
1.2.1. Образование бинарного комплекса.
1.2.2. Образование инициаторного комплекса.
1.2.3. Образование инициаторного комплекса.
1.3. Альтернативный способ I зависимой инициации трансляции у ВГС
1.4. Функциональная роль доменов I ВГС в инициации трансляции
1.4.1. Функциональная роль домена III
1.4. 1. 1. Влияние мутаций I ВГС па эффективность инициации трансляции.
1.4.1.2. Участие домена III в связывании I ВГС с субчастицей
1.4.1.3. Участие домена III I ВГС в его связывании с I3.
1.4.1.4. Участие домена III I в формировании и комплексов инициаци.
1.4.2. Функциональная роль домена II.
1.4.2.1. Участие домена И в высвобождении фактора 2
1.4.2.2. Влияние структуры домена И на функционирование I ВГС.
1.4.2.3. Взаимосвязь домена II и рибосомпого белка
1.4.3. Функциональная роль других районов
1.5. Структура комплексов инициации I ВГС поданным криоЭМ и сшивок
1.5.1. Взаимодействие I с субчастицсй рибосомы
1.5.2. Комплекс I ВГС с фактором инициации I3.
1.5.3. Структур пая модель II3 комплекса.
1.5.4.8инициаторный комплекс
1.5.4.1. Конформационные перестройки субчастиц, вызванные связыванием I ВГС с рибосомой
1.5.4.2. Структура I ВГС в комплексе
1.5.4.3. Контакты I ВГС в вОЯкомплексе
1.6. Дополнительные факторы, влияющие на эффективность трансляции мРЫК вируса гепатита С.
1.7. Заключение.
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть.
2.1. Материалы.
2.2. Выделение рибосомных субчасгиц из плаценты человека.
2.3. Наработка и выделение плазмиды X2
2.4. Получение I ВГС с помощью Т7транскрипции
2.4.1. Получение статистически Рмсченого I ВГС.
2.4.2. Получение биотинилированого слабомеченого I ВГС.
2.5. Фосфорилирование олигонуклеотидов по 5концу.
2.6. Получение 4ГчхлорэтилЫметиламинобензил5фосфамидов олигодсзоксирибонуклсотидов
2.7. Сайтнаправленное введение фотоактивируемой группы в I ВГС
2.7.1. Комплементарноадресованная модификация I ВГС
2.7.2. Гидролиз фосфамидной связи
2.7.3. Введение перфторфенилазидогруппы
2.8. Гидролиз ковалентных аддуктов I ВГС с помощью РНКазы Н
2.9. Определение модифицированных нуклеотидов в I ВГС с помощью метода обратной транскрипции
2 Получение бинарных комплексов рибосомных субчастиц с I ВГС и его фотоактинируемыми производными.
2 Определение степени связывания I ВГС и его производных с субчастицами.
2 Фотоаффинная модификация субчастиц производными I ВГС.
2 Выделение бинарных комплексов субчастиц с 1 ВГС и его фотактивируемыми производными с помощью сахарозного градиента.
2 Разделение модифицированных субчасгиц на РНК и белки с помощью сахарозного градиента
2 Выделение суммарной РНК из модифицированных субчастиц
2 Анализ модификации рРНК электрофорезом в агарозе.
2 Выделение рибосомных белков из комплексов субчастиц с производными I ВГС
2 Выделение рибосомных белков, сшитых с производными биотинилированного I
2 Выделение суммарного белка субчастицы экстракцией уксусной кислотой
2 Определение модифицированных рибосомных белков с помощью одномерного гельзлектрофореза
2 Определение модифицированных рибосомных белков с помощью двумерного гельэлектрофореза
2 Анализ модифицированных белков с помощью иммунопреципитации
ГЛАВА 3. Молекулярное окружение Iэлсмента ГНК вируса гепатита С на субчастице рибосомы человека.
3.1. Исследование роли различных доменов I ВГС в связывании с
субчастицей
3.1.1. Критерии выбора олигодезоксирибопуклеотидов для
комплементарноадресованной модификации.
3.1.2. Получение ковалентных аддуктов Рмеченого I ВГС с производными олигодезоксирибонуклсотидов
3.1.3. Анализ связывания аддуктов I ВГС с рибосомными субчастицами.
3.2. Получение и характеризация производных I ВГС.
3.2.1. Введение фотактивируемых групп в определенные положения I ВГС.
3.2.2. Определение модифицированных нуклеотидов I ВГС
3.2.3. Связывание фотоактивируемых производных I ВГС с субчастицами
3.3. Определение компонентов субчастнцы, сшивающихся
с производными 1 ВГС
3.3.1. Сшивка производных I ВГС с субчастицей и анализ модификации
3.3.2. Определение белков, сшитых с производными I ВГС
в бинарном комплексе
3.3.2.1. Особенности идентификации сшитых белков.
3.3.2.2. Определение белков субчастицы, сшитых с РНК IV и VII.
3.3.2.3. Определение белков, сшитых с РНК III, V и VIII.
3.4. Рибосомные компоненты, окружающие I ВГС субчастице
3.5. Соотнесение полученных данных с данными криоэлектронной микроскопии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
I одномерный 2 двумерный
бактериальная малая рибосомная субчастица
, и эукариотические малая, большая рибосомные субчастицы и рибосома
5 и ЗНТО 5 и Знетранслирусмые области мРНК
, и т.д. общепринятые обозначения 5трифосфатов нуклеозидов
бромфеноловый синий
I 4М2хлорэтилМметиламинобензиламин
димстилсульфоксид
1,4дитио0,Ьтреитол
зтилсндиаминтетрауксусная кислота
гуанилилимидодифосфат
Ы2гидроксиэтилпиперазинЫ2этансульфоовая кислота НАс уксусная кислота
1 внутренний сайт посадки рибосомы от англ. I i i
ацетат натрия
2Мморфолиноэтансульфоновая кислота I пипсразинЫ,Гбис2этансульфоновая кислота промин киназа от англ. i i
додецилсульфат натрия
X метод систематического отбора лигандов путем экспоненциального обогащения от англ. i vi i xi i
1 инициаторная метиониновая аминоацилтРНК
X ксиленцианол
аминокислотный остаток
ЬСА бычий сывороточный альбумин
ЕГС вирус гепатита С
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
Аучасток аминоацильный или акцепторный участок связывания тРНК на рибосоме
Ручасток пептидильный или донорный участок связывания тРНК на рибосоме
Еучасток специфический участок на рибосоме для связывания деацилированной тРНК
ИХБФМ СО РАН Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук
кДНК комплементарная ДНК
криоЭМ криоэлектронная микроскопия
МГ У Московский государственный университет
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
НИИ ФХБ Научноисследовательский институт физикохимической биологии НПО научнопроизводственное объединение нт нуклеотид ОЕ оптические единицы
офВЭЖХ обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
ПААГ полиакриламидный гель
рРНК рибосомная рибонуклеиновая кислота
РСА рентгеноструктурный анализ
Грис трисгидроксиметиламинометан
тРНК транспортная рибонуклеиновая кислота
ТХУ зрихлоруксусная кислота
ТЭА триэтиламин
УФ ультрафиолетовый
ЦКБ 1 Центральная клиническая больница
ЯМР ядерный магнитный резонанс
А ангстрем
X длина волны
ВВЕДЕНИЕ


Оказалось, что большинство I абсолютно не похожи друг на друга, у них отсутствует какойлибо элемент структуры первичной, вторичной или третичной, общий для всех I. Не существует также единого механизма функционирования Iэлементов в процессе трансляции, аналогичного механизму кэпзависимой инициации трансляции. Тем не менее, на данный момент можно выделить общие принципы, лежащие в основе внутренней инициации трансляции, и описать несколько основных способов функционирования Iэлементов. Так, например, по механизму связывания с
субчастицсй Iэлемеиты вирусов подразделяют на зри основные группы группа I, подобных 1 вируса энцефаломиокордита, группа I, подобных I вируса гепатита С, и группа I, подобных I вируса паралича сверчка см. Однако молекулярные основы взаимодействий, обеспечивающих функционирование элемеитов в процессе инициации трансляции различных вирусных РНК остаются малоизученными. Большая часть накопленной к настоящему времени информации относится к Iэлементу РНК вируса гепатита С ВГС см. Вирус гепатита С относится к РНКсодержащим вирусам и принадлежит к роду ivi Гепацивирусов семейства vivii Флавивирусов. Его геном представлен линейной плюсцепыо РНК длиной около ит и имеет одну открытую рамку считывания, при трансляции которой образуется полипрогсин, состоящий примерно из ао. При расщеплении полипротеина образуются три структурных и четыре неструктурных белка. На бконцс геномной РНК расположена нетранслируемая область НТО, за которой следуют ген С, кодирующий белок нуклеокапсида, гены Е1 и , кодирующие гликопротеины внешней оболочки, и гены 2, 3, 4 и 5, кодирующие неструктурные белки . Очевидно, что трансляция является одной из важнейших стадий жизненного цикла ВГС. В настоящем обзоре суммированы структурные и биохимические данные о строении и функционировании I ВГС, а также о его взаимодействии с рибосомами, факторами инициации трансляции и с некоторыми другими клеточными белками. Особое внимание уделено структурнофункциональной организации I ВГС и его комплексам с рибосомами. Обзор охватывает в основном все данные, касающиеся этих вопросов, опубликованные с момента открытия внутренней инициации трансляции РНК ВГС. Iэлемент ВГС имеет длину 1 нт и занимает почти всю 5НТО геномной РНК I7. Граница I с 5стороны находится в районе ого нуклеотида , фрагмент 5НТО, включающий первые нт, представляет собой шпильку, формирующую домен I, который не входит в Iэлемент. Относительно Заграницы Iэлемента мнения немного расходятся, но наиболее общепринятым является предположение, что район, содержащий инициаторный кодон и несколько нуклеотидов кодирующей последовательности, входит в состав Iэлемента и является необходимым для эффективной инициации трансляции , . Геном вируса гепатита С обладает большой генетической вариабельностью. Так, в настоящее время выделяют шесть генотипов ВГС вариабельность , которые в свою очередь подразделяются на несколько субтипов вариабельность , обозначаемых строчными буквами , 1Ь и т. При этом у одного пациента РНК ВГС может варьировать в пределах по первичной структуре . Кроме того, у одного больного можно выделить сразу несколько вариантов вируса, так называемых псевдо или квазивидов 1 различий по нуклеотидной последовательности. По неоднородность нуклеотидной последовательности характерна в основном для кодирующей области РНК, в то время как ее нетранслирусмыс участки отличаются высокой консервативностью первичной структуры . Такая консервативность, повидимому, важна для поддержания сложной вторичной и третичной структур этих участков, обеспечивающих их функционирование в процессе жизнедеятельности ВГС. Предполагаемая вторичная структура I ВГС рис. Iэлементами родственных пестивирусов и вирусаВ , , химическом и ферментативном пробингс , и мутационном анализе , . I ВГС состоит из двух больших спиральных доменов II и III, соединенных с помощью псевдоузла с коротким стсблепетлсвым доменом IV, который содержит инициаторный кодон и часть кодирующей последовательност и рис. Домен II представляет собой протяженную неидеальную шпильку, иногда искусственно разделяемую на субдомены На и i. Домен III состоит из шести шпилек III.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.225, запросов: 121