Выделение и структурно-функциональная характеристика металлопротеиназы и сериновой коллагенолитической протеиназы-2 камчатского краба (Paralithodes camtschatica)

Выделение и структурно-функциональная характеристика металлопротеиназы и сериновой коллагенолитической протеиназы-2 камчатского краба (Paralithodes camtschatica)

Автор: Семенова, Светлана Александровна

Год защиты: 2008

Место защиты: Москва

Количество страниц: 148 с. ил.

Артикул: 4244117

Автор: Семенова, Светлана Александровна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Стоимость: 250 руб.

Выделение и структурно-функциональная характеристика металлопротеиназы и сериновой коллагенолитической протеиназы-2 камчатского краба (Paralithodes camtschatica)  Выделение и структурно-функциональная характеристика металлопротеиназы и сериновой коллагенолитической протеиназы-2 камчатского краба (Paralithodes camtschatica) 

Введение
1. Обзор литературы.
1.1. Металлопротеиназы семейства астацина.
1.2. Структура, биосинтез и локализация астациновых протеиназ
1.2.1. Структура генов
1.2.2. Особенности биосинтеза.
1.2.3. Активация проферментов.
1.2.4. Гликозилирование.
1.2.5. Пространственная структура и доменный состав.
1.2.6. Значение доменной структуры для транспорта и процессинга
1.2.7. Локализация
1.3. Физикохимические и энзиматические свойства астациновых протеиназ.
1.3.1. Физикохимические свойства.
1.3.2. Особенности гидролиза пептидной связи
1.3.3. Роль ионов металлов
1.3.4. Определение активности.
1.3.5. Субстратная специфичность
1.3.6. Белковые субстраты.
1.3.7. Амидазная активность.
1.3.8. Значение доменной структуры для энзиматических свойств
1.3.9. Ингибирование
1.4. Получение астациновых протеиназ.
1.4.1. Общая характеристика методик выделения.
1.4.2. Получение рекомбинантных астациновых металлопротеиназ
1.5. Физиологическая роль астациновых металлопротеиназ.
1.5.1. Участие в пищеварении
1.5.2. Участие в формировании и распаде межклеточного матрикса
1.5.3. Функции в процессах морфогенеза и развития организма.
1.6. Брахиурины сериновые протеиназы ракообразных
1.6.1. Общая характеристика.
1.6.2. Структура
1.6.3. Субстратная специфичность
1.6.4. Гидролиз коллагена брахиуринами
1.6.5. Ингибирование брахиуринов
1.6.6. Физикохимические и энзиматические свойства брахиуринов
1.6.7. Получение брахиуринов
1.6.8. Биологические особенности брахиуринов
1.7. Использование протеиназ ракообразных в медицине.
1.8. Исследования протеиназ из гепатопаикреаса камчатского краба.
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. Очистка протеиназ.
2.2. Определение частичной аминокислотной последовательности сериновой коллагенолитической протеиназы2.
2.3. Физикохимические и энзиматические свойства сериновой коллагенолитической лротсиназы
2.4. Ингибирование сериновой коллагенолитической нротеиназы
2.5. Субстратная специфичность сериновой коллагенолитической протсиназы2.
2.6. Исследование первичной структуры металлопротеиназы
2.7. Физикохимические и энзиматические свойства металлопротеиназы.
2.8. Ингибирование металлопротеиназы.
2.9. Субстратная специфичность металлопротеиназы.
2 Сравнение аминокислотной последовательности металлопротеиназы краба и других астациновых протеиназ
2 Моделирование пространственной структуры металлопротеиназы
2 Построение филогенетического древа астациновых протеиназ.
2 Влияние температуры на кинетические параметры гидролиза субстратов протеиназами краба.
2 Действие протеиназ краба на коллаген.
2 Действие протеиназ краба на фибриноген.
2 Действие протеиназ краба на фибрин, плазминоген и плазму крови.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы
3.1.1. Синтетические хромогенные субстраты.
3.1.2. Ферменты, белки, пептиды
3.1.3. Прочие реактивы и сорбенты.
3.2. Методы.
3.2.1. Аффинная хроматография на полимиксинсилохроме
3.2.2. Аффинная хроматография наЫНОНВ1А1аА1асилохроме
3.2.3. Гидрофобная хроматография.
3.2.4. Аффинная хроматография на лейцинсилохроме
3.2.5. Аффинная хроматография на аргиииисилохроме.
3.2.6. Гельхроматография на Сефадсксе С
3.2.7. Ионообменная хроматография на ЕЕАЕТоуореаг1.
3.2.8. Концентрирование и обессоливание растворов белков.
3.2.9. Определение концентрации белка по методу Бредфорд.
3.2 Определение активности по динитрофенилпептидам
3.2 Определение активности по янитроанилидам пептидов
3.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
3.2 Массспскгрометрический анализ.
3.пределение субстратной специфичности металлопрогеиназы.
3.2 Определение рНоптимума активности ферментов.
3.2 Определение активности протеиназ по азоказеину
и азоальбумину.
3.2 Определение зависимости активности протеиназ от температуры.
3.2 Определение кинетических параметров протеолиза
3.2 Ингибиторный анализ.
3.2 Исследование действия протеиназ на коллаген.
3.2 Действие протеиназ краба на фибриноген и другие белки
3.2 Действие протеиназ краба на фибриновые пластины.
3.2 Действие протеиназ краба на фибриновые сгустки
3.2 Действие протеиназ краба на плазму крови
3.2 Определение содержания цинка в молекуле металлопротеиназы
3.2 Клонирование и секвенирование кДНК металлопротеиназы
3.2 Компьютерный анализ данных и моделирование структуры белков
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВМР1 белок морфогенеза костной ткани1 шфi i
бензоил
диэтиламиноэтил
динитрофенил
дансил диметиламииоиафталинсульфонил
дитиотреитол
Е трансэпоксисукниниллейциламидо 4гуанидинобутан
фурилакрилоил
пироглутамил
I ixi i iii
морфолиноэтансульфокислота
1 белок млекопитающих, подобный продукту гена i дрозофилы i ii
фенилметилсульфонил фторид
i изоэлектрическая точка
пнитроаннлид
додецилсульфат натрия
сукцинил
, , , тетраметилэтилендиамин
трансформирующий фактор роста р
i трисоксиметиламинометан
итолуолсульфонил
бензилокси карбонил
КМцеллюлоза карбоксиметилцеллюлоза
ОФ ВЭЖХ обращнюфазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
ПААГ полиакриламидный гель
СКП сериновая коллагенолитическая протеи паза
ТХУ трихлоруксусная кислота
ФИТЦ фенилизотиоцианат
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
Э1ТА этиленгликольбис РаминоэтилэфирЫ, , , тетрауксусная кислота
В работе использовались международные трхбуквенные и однобуквенны
обозначения аминокислот
ВВЕДЕНИЕ


Астацин пищеварительный фермент речного рака был впервые описан в году. Астациновые металлопротеиназы были выделены в самостоятельное семейство в х гг. XX в. С тех пор были получены и исследованы более двадцати представителей этого семейства ферменты бактерий, беспозвоночных и позвоночных животных. При анализе базы данных I с помощью программы в году было обнаружено более 0 последовательностей белков, сходных с онхоастацином протеиназой паразитического червя vv 6, Следует отметить, что у растений и вирусов не обнаружено ни ферментов, относящихся к семейству астацина, ни генов, кодирующих такие белки 3. Наибольшее число генов протеиназ семейства астацина было обнаружено в геноме нематоды ii i, 7. В геноме человека таких генов 6, . Некоторые из генов астацинов нематоды, вероятно, образовались в результате дупликации 7. Гены протеиназ семейства астацина, близких по числу аминокислотных остатков, значительно различаются по числу экзонов. Среди генов хориолизинов Н протеиназ, участвующих в вылуплении мальков различных видов рыб встречаются как моноцистронные например, у японской рисовой рыбки i i и рыбы фугу i i 9, так и полицистронные ген хориолизина Н рыбы аю ivi содержит 9 экзонов, при том, что количество аминокислотных остатках в препробелках от
до 9. Ген астацина речного рака содержит 5 экзонов и 4 интрона, один из которых находится в участке ДНК, кодирующем сигнальный пептид. Расположение экзонов и нитронов в генах астациновых протеиназ коррелирует с вторичной структурой белков. Последовательности, кодирующие структурно и функционально важные элементы протеолитических доменов ферментов аспирали, слои, цинксвязывающий мотив и метиониновый поворот, не прерываются нитронами , . Границы экзонов в генах ВР морского ежа i ivi и i . Различие в числе копий генов хориолизинов Н и рисовой рыбки 8 и 1 копия, соответственно, вероятно, обусловлено тем, что для эффективного гидролиза оболочки икринки необходимо совместное действие хориолизинов и Н, причм оптимальное соотношение их количеств 3 . Существование изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, характерно только для астацинов позвоночных животных, принадлежащих к подсемейству ВМР1. В организме человека обнаружены шесть изоформ мРНК ВМР1 , но из белков, кодируемых этими изоформами, изучены лишь два i i, сходный с продуктом гена i . ВМР1. Различия между изоформами мРНК 3субъединицы меприна протеиназы из эпителия почек и кишечника, одна из которых обнаружена только в опухолевых клетках, сосредоточены в 5нетранслируемой области и не влияют на структуру белка 5, р. Гены а и 3субъединиц мепринов расположены на разных хромосомах. Благодаря этому соотношение количеств субъединиц может регулироваться на уровне экспрессии генов в зависимости от стадии развития организма или локализации клеток . Практически все гены астациновых протеиназ, за исключением САМ1 перепела ix ix и . В 9 из генов астациновых протеиназ С. Вероятно, продуктами этих генов являются внутриклеточные ферменты, но сделать окончательный вывод можно будет только после изучения соответствующих белков 7. Белок i продукт гена i1 содержит пропептид из 9 аминокислот возможно, такая структура гена позволяет предотвратить образование белка на ранних стадиях эмбриогенеза, когда длительность клеточного цикла мата . Анализ аминокислотных последовательностей показал, что активация большинства проастацинов может происходить в результате действия трипсина или трипсиноподобных ферментов. Исключениями являются нефрозин карпа i i , протсиназа пресноводной гидры Кvi НМР1 , протеиназа РМР1 медузы сагпса , астацин и эмбриональный астацин речного рака , а также белок 4 . Сконца пропептида этого белка находятся остатки аргинина . Скоице пропептидов некоторых астацинов находятся мотивы XX, что указывает на возможность внутриклеточной активации в результате отщепления пропептида фурином. Секретируемая протеиназа ВМР1 активируется фурином, но отщепление пронептида не является необходимым условием секреции . Активация проферментов хориолизинов рыбы . ЭДТА 5, р.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.199, запросов: 121