Структура и функции протимозина альфа

Структура и функции протимозина альфа

Автор: Евстафьева, Александра Георгиевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2006

Место защиты: Москва

Количество страниц: 263 с. ил.

Артикул: 3309376

Автор: Евстафьева, Александра Георгиевна

Стоимость: 250 руб.

Структура и функции протимозина альфа  Структура и функции протимозина альфа 

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ
ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМОВ ЕГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ
обзор литературы
1.1. СТРУКТУРА ПРОТИМОЗИА АЛЬФА
1.1.1. Первичная структура ПроТа
1.1.2. ПроТа как природный неструктурированный белок
1.1.3. Носттрансляционныс химические модификации ПроТа
1.2. ГЕН ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ
1.2.1. Гены и псевдогены ПроТа
1.2.2. Регу ляция экспрессии гена про тимозина а
.2.1. Ебокс и регуляция белком Мус
1.2.2.2. Роль фактора А Р2
1.2.2.3. Потенциальная регуляция фактором Е2Е
1.2.2.4. Эстрогеиовыйрецептор и фактор
1.2.2.5. Опухолевый супрессор р
1.2.2.6. Онкобелок Еб вируса папилломы человека
1.3. ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА
1.4. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА, КЛЕТОЧНОЕ ДЕЛЕНИЕ И ДИФФЕРЕ1ЦИРОВКА
1.4.1. Корреляция уровня ПроТа с пролиферативным статусом клетки
1.4.2. ПроТа и клеточный цикл
1.4.3. Корреляция уровня мРНК ПроТа с экспрессией сшус
1.4.4. Прямые доказательства участия ПроТа в процессах, связанных с делением клеток
1.4.5. ПроТа н клеточная диффереицнровка
1.5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА С ГИСТОНОМ Н1. ВЛИЯНИЕ НА СТРУКТУРУ ХРОМАТИНА
1.6. ПОИСК НОВЫХ БЕЛОКБЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ.
ДРОЖЖЕВАЯ ДВУХГИБРИДНАЯ СИСТЕМА
1.6.1. Что такое дрожжевая двухгибридная система
1.6.2. Преимущества дрожжевой двухгибридной системы
1.6.3. Недостатки двухгнбрндной системы и методы их преодоления
1.6.4. Поиск новых белокбелковых взаимодействий с помощью дрожжевой двухгнбрндной системы
1.7. ПОИСК НОВЫХ БЕЛОКБЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С УЧАСТИЕМ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА
1.7.1. Взаимодействие ПроТа с репрессором эетрогенового
рецептора
1.7.2. Взаимодействие ПроТа с белком 3 вируса ЭпштейнаБарр
и гнетоновыми ацетнлтрансфсразамн рЗООСВР
1. 7.2.1. Взаимодействие ПроТа с белком 3 вируса ЭпштейнаБарр
1.7.2.2. Взаимодействие ПроТа с гистоновыми ацетиптрансферазами
1.7.2.3. Функциональная значимость взаимодействий ПроТа СВР и
ПроТа
1.7.3. Взаимодействие ПроТа с транскрипционным фактором
в ответ на действие интерферона
1.7.4. Взаимодействие ПроТа с онкобелком
1.7.5. Другие белокбелковые взаимодействия с участием ИроТа
1.7.6. Заключительные замечания
1.8. МЕТОД ИНТЕРФЕРЕНЦИИ РНК И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ
ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИЙ БЕЛКОВ
1.8.1. Механизм интерференции РНК
1.8.2. Особенности интерференции РНК в клетках млекопитающих
.3. Системы практического осуществлении интерференции РНК в клетках высших эукариот
I.9. ПГОТИМОЗИН АЛЬФА И АПОПТОЗ
ПРОТИМОЗИН АЛЬФА II ОПУХОЛЕВАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ
. Протимознн а предполагаемый оикобелок
. Протимознн а активирует экспрессию рзавпсимых генов
ГЛАВА II. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА обсуждение результатов
II.1. РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТИМОЗИН АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА ПРОДУКЦИЯ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ, ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА
.1.1. Оптимизация продукции ПроТа человека в клетках .i И.1.2. Разработка метода выделении биологически активного рекомбинантного ПроТа из бактериальных клеток
И.1.3. Получение ПроТаснсцнфнчных моноклональных антител, их
свойства и антигенная специфичность
И.1.4. Исследование металлсвязывающих свойств ПроТа
II. 1.4.1. ПроТа связывается с ионообменной смолой, заряженной двухвалентными катионами
II. 1.4.2. Анализ взаимодействия ПроТа с ионами 2 и Са2 методом равновесного диализа
II. 1.4.3. Влияние ионов металлов на взаимодействие ПроТа с другими белками
II.2. СТРУКТУРНО ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ЭКСПРЕСИН В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ
.2.1. Эктопическая экспрессия ПроТа человека в клетках vii
П.2.2. Возможность использования ПроТа в качестве репортера в клетках vii
.2.3. Идентификация функционально значимых мутации в ПроТа
.2.4. Обнаружение двухчастного в ПроТа
Н.З. ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ПРОТИМОЗИПА АЛЬФА В
КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
.3.1. Оптимизация эктопической экспрессии ПроТа в клетках
.3.2. Снижение внутриклеточной концентрации ПроТа методом интерференции РНК
.3.2.1. Подбор оптимального фрагментамишени для ПроТаспсцифической интерференции РНК
II. 3.2.2. Создание интерференционных плазмид и введение их
в клетки Не
II. 3.2.3. Снижение уровня мРНК ПроТа в клетках , экспрессирующих i, и исследование специфичности этого эффекта
II. 3.2.4. Снижения уровня ПроТа в клетках , экспрессирующих i, и исследование специфичности этого эффекта
II. 3.2.5. Сравнение эффективности i к разным фрагментам мишеням на мРНК ПроТа, транскрибируемых с Н1 и 6 промоторов
.4. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА В АПОПТОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ
.4.1. Фрагментация ПроТа в апоп готических клетках
.4.2. Гидролиз ПроТа каспазами3 и 7 i vi
И.4.3. Участки каспазиого гидролиза ПроТа i viv
II.4.4. Изменение внутриклеточной локализации ПроТа в апоптотнчсских клетках
П.4.5. Суперпродукция ПроТа и его мутантов защищает
клетки от апонтоза
.5. ПОИСК БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ПРОТИМОЗИНОМ АЛЬФА, С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕВОЙ ДВУХГИБРИДНОЙ СИСТЕМЫ
И.5.1. Принцип работы дрожжевой двухгибридной системы
.5.2. Дрожжевая двухгибридная система на основе x
П.5.3. ПроТа человека не является автоактиватором транскрипции
II.5.4. Скрининг библиотек кДНК с помощью дрожжевой двухгибридной системы
П.5.5. Определение участков белков, ответственных за взаимодействие ПроТа и
П.5.6. Получение моноклональных антител к
И.5.7. Взаимодействие ПроТа i vi
П.6. РОЛЬ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА В ЗАЩИТЕ КЛЕТОК ОТ
ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
.6.1. Модель регуляции клеточного ответа на окислительный
стресс
.6.2. Как ПроТа может встретиться с в клетке
И.6.3. ПроТа конкурирует с 2 за связывание с
II.6.4. ПроТа влияет на 1ЧтгПзависимую генную экспрессию
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬН АЯ ЧАСТЬ
IV. ВЫВОДЫ
V. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
активирующий транскрипцию белковый домен АНС 8анилино 1нафтален сульфонат
участок ДНК, регулирующий индуцируемые при окислительном стрессе гены 3АТ 3амино1,2,4триазол i биотин
В бромфеноловый синий
хлорамфеникол ацетилтрансфераза и ее ген
СВР ii i коактиватор транскрипции
белковый фактор, связывающийся с
, ДНКсвязывающий белковый домен
диэтилмалеат
диэтилпирокарбонаг
смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
Егэстрадиол
3 ядерный антиген ЗС вируса ЭпштейнаБарр
участок связывания эстрогснового рецептора на ДНК
бычья эмбриональная сыворотка
I флуоресцешшзотиоцианат
5 5фтороротовая кислота
глицерапьдегид3фосфатдегидрогеназа
зеленый флуоресцирующий белок
глутатионБтраисфсраза
НА эпитоп гемаглютинина
гистоновые ацетилтрансферазы
гистоновые деацетилазы
К2гидроксиэтилпиперазинЫэтансульфоновая кислота
IV1 вирус иммунодефицита человека
НО1 гемокснгеназа
пероксидаза хрена
V1 вирус Тклеточной лейкемии
V вирус папилломы человека
1 i i i участок внутренней инициации трансляции фрагмент Кленова ДНКполимеразы 1 .i
ii
лептомицин В
ген люциферазы светлячков
сигнал ядерной локализации
сигнал экспорта из ядра
онитрофенилР1галактопиранозид
РЕТСМ атрихлорметил4пиридинэтанол
протеинкиназа
фснилмстилсульфонатфторид
РгоТа, МРгоТа, протимозин альфа и его мутант , пурин Ру пиримидин
РНКзависимая РНКполимераза
репрессор рецептора эстрогенов
последовательность ШайнДальгарно
додецилсульфат натрия
i короткая интерферирующая РНК
короткая шпилечная РНК
1 коактиватор стероидных рецепторов
i вариант дрожжевой двухгибридной системы
обменивающий фактор
стрептавидин
ТАТА минимальный промотор
ivi предпромоторный регуляторный участок ДНК 3, 5 3, 5нетранслируемый район мРНК V белка Р вируса герпеса
X 5бромо4хлоро3индолилр0галактопиранозид
V фторметилкетон карбобензоксиаспарагснилглутамилвалил
аспарагиновой кислоты
V фторметилкетон карбобензоксивалилаланил аспарагиновой кислоты
Iсвязывающий домен белка А золотистого стафилококка БСА бычий сывороточный альбумин ВЭМК вирус энцефаломиокардита ДМСО диметилсульфоксид
ДМФА Ы,Ндиметилформамид
ДСП додецилсульфат натрия
ДТТ дитиотреитол
дцРНК двуцепочечная РНК
ИПТГ изопропилрЭтиогалактозид
КД круговой дихроизм
мАТ моноклональные антитела
НК нуклеиновая кислота
ПроТа протимозин альфа
ПМР протонный магнитный резонанс
ПАГЕ полиакриламидный гельэлектрофорез
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
ТЕМЕД М, Ы, тетраметилендиамин
тл.н. тысяча пар нуклеотидных остатков
Трис трисгидроксиметиламинометан
ТХУ трихлоруксусная кислота
ФИО фактор некроза опухолей
ЭБ вирус ЭпштейнаБарр
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ЭР эстрогеновый рецептор
ВВЕДЕНИЕ


Результаты экспериментов по изменению электрофоретической подвижности ДНК при связывании с белками показали, что Мус связывался с участком нитрона, содержащего этот сайт. Стимуляция транскрипции гена протимозина а, осуществляемая Мус, была зарегистрировала также при использовании другой, менее искусственной системы . В этом случае активатором служил модифицированный Мус его синтез регулировался при помощи ii металлотионеинового промотора. Однако, по данным работ группы Ш. Бергер экспрессия гена протимозина а человека не зависит от Мус. В этом гене было обнаружено два Ебокса , первый в промоторной области, на расстоянии пар нуклеотидных остатков до точки начала транскрипции, а второй внутри первого нитрона. Репортсриый ген был помещен под контроль промоторного района 5 т. Активность репортера не изменялась в клетках с различным уровнем Мус. Авторы изучили также эктопическую экспрессию полноразмерного гена протимозина а под контролем его родного промотора. В трансфицированных клетках уровень ПроТа был таким же, как и при использовании мутантного гена, лишнного первого интрона, или гена с мутированными Ебоксами. При эктопической экспрессии в этих клеткх Мус, а также его доминантнонегативного мутанта, уровень экспрессии протимозина а оставался постоянным . После публикации результатов Бергер с соавт. В последующей статье группы Эйлерса было показано, что репортерный ген , находящийся под контролем части промоторной области ПроТа крысы 0 п. I, интрон I и часть экзона И, активировался в присутствии Мус дикого типа, но не в присутствии Мус, содержащего мутантный ДНКсвязывающий домен. Мутации в Ебоксе приводили к отсутствию активации репортера. Была выявлена корреляция между способностью различных мутантов Мус трансформировать клетки и их активирующим влиянием на транскрипцию с промотора ПроТа. Результаты цикла работ Эйлерса с соавт. Мус экспрессии гена ПроТа, однако отрицательные результаты их оппонентов остаются необъяснснными. I нитрона человека и крысы. Активный Ебокс в гене крысы , находится на расстоянии пар нуклеотидных остатков отточки начала транскрипции, тогда как аналогичный Ебокс в гене человека, изучаемый Бергер с сотр. Нельзя исключить, что регуляция экспрессии генов ПроТа крысы и человека может различаться. Кроме того, последовательность Ебокса подчеркнут и его окружения в I нитроне гена человека . Эйлерса с соавт. Бергер с соавт. Такое впечатление, что эти две группы работали с различающимися по первичной структуре генами. Рядом с Ебоксом I нитрона ПроТа был обнаружен ещ один потенциально активный сайт . Эта последовательность соответствует консенсусу сайта связывания транскрипционного фактора АР2. Такая же последовательность находится в регуляторной области гена орнитиндекарбоксилазы, который тоже регулируется Мус при индукции клеточного деления . Опыты по изменению электрофоретической подвижности в геле показали, что рекомбинантный АР2 специфично связывался с членным олигонуклеотидом, содержащим последовательность из I нитрона ПроТа крысы Ебокс подчеркнут, потенциальный сайт связывания АР2 выделен жирным шрифтом. При этом АР2 защищал от гидролиза ДНКазой 1 не только участок , но и центральную область Ебокса. То, что АР2 конкурирует с гетеродимером МусМах и гомодимером МахМах за связывание с окрестностями Ебокса, было прямо показано в опытах по вытеснению белков из комплекса с ДНК . Опыты по взаимодействию белков i vi были дополнены экспериментами с репортериыми конструкциями i viv. Эктопическая экспрессия АР2 в клетках дозозависимо подавляла активированную белком Мус транскрипцию репортерного гена, находящегося под контролем участка I нитрона гена ПроТа крысы, содержащего Ебокс и потенциальный сайт связывания АР2 . Итак, исследования Эйлерса с сотр. Мус находится иод негативным контролем фактора АР2. Оказалось, что это может происходить по двум разным механизмам. Вопервых, за счет перекрывания сайтов связывания Мус и АР2, фактор АР2 конкурирует с гетеродимерами МусМах при связывании с регуляторной последовательностью ДНК и ингибирует активацию синтеза мРНК протимозина а.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.287, запросов: 121