Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга

Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга

Автор: Агапкина, Юлия Юрьевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2004

Место защиты: Москва

Количество страниц: 142 с. ил.

Артикул: 3297346

Автор: Агапкина, Юлия Юрьевна

Стоимость: 250 руб.

Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга  Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга 

СОДЕРЖАНИЕ
Список принятых сокращений
Введение
I. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ
обзор литературы.
1.1. СТРОЕНИЕ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ1.
1.1.1. Строение каталитического домена.
1.1.2. Строение Ыконневого домена.
1.1.3. Строение Сконцсвого домена.
1.1.4. Строение мутантных белков, содержащих
два домена интегразы
1.1.5. Мультимерная организация интегразы
1.2. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ1.
1.2.1. Реакции, катализируемые интегразой
1.2.2. Связывание ДНК интегразой.
1.2.3. Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК
1.2.4. Участие аминокислотных остатков интегразы
во взаимодействии с ДНК.
1.2.5. Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК.
1.2.5.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНКсубстрата на каталитическую активность интегразы.
1.2.5.2. Моделирование предпочтительной нуклеотидной последовательности ДНКсубстрата
1.2.6. Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК
I.3. МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ФЕРМЕНТА И ЕГО КОМПЛЕКСА С ДНК
II. ИНТЕГРАЗА ВИЧ1 ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ДНКСУБСТРАТА НА АКТИВНОСТЬ В РЕАКЦИИ ЗКОНЦЕВОГО ПРОЦЕССИНГА
Результаты и обсуждение
II.1. ДИЗАЙН МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ 5СУБСТРАТА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ1.
.2. ТЕРМИЧЕСКАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ ШСУБСТРАТА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ1
.3. ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗУЕМОЙ В РАБОТЕ ИНТЕГРАЗЫ.
.4. СВЯЗЫВАНИЕ ИНТЕГРАЗЫ С РАЗЛИЧНЫМИ
ДНКДУ ПЛ ЕКС АМН
.4.1. Изучение связывания интегразы с ДНК
методом торможения в геле
.4.2. Изучение связывания интегразы с ДНК
методом поляризации флюоресценции
И.4.3. Изучение связывания интегразы с ДНК
методом фотоаффинной модификации.
И.5. ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИЙ СУБСТРАТА
НА СПЕЦИФИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИНТЕГРАЗЫ
II..1. Модификации нуклеозидов
в 3ем положении и5субстрата
9 .5.2. Модификации нуклеозидов
в 5ом и 6ом положениях Шсубстрата
П.5.3. Модификации нуклеозидов
в 7ом и 8ом положениях Шсубстрата
Н.5.4. Модификации нуклеозидов
в 9ом положении и5субстрата.
.5.5. Модификации нуклеозидов
в ом положении и5субстрата
П.6. ВЛИЯНИЕ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ ДНК В РАЙОНЕ РАСЩЕПЛЯЕМОЙ
СВЯЗИ НА АКТИВНОСТЬ ИНТЕГРАЗЫ.
.6.1. Изучение взаимодействия интегразы с аналогом и5субстрата с
ковалентно связанными цепями
.6.1.1. Синтез субстрата интегразы
ф с ковалентно связанными цепями
.6.1.2. Реакция 3 концевого процессинга субстрата
с ковалентно связанными цепями
Н.6.2. Процессинг субстратов, в которых консервативный динуклеотид
СА расположен во внутренней части дуплекса
.7. ИЗУЧЕНИЕ КОНТАКТОВ АДЕНИНА
В ТРЕТЬЕМ ПОЛОЖЕНИИ ПРОЦЕССИРУЕМОЙ ЦЕПИ
ШСУБСТРАТА С ИИТЕГРАЗОЙ.
.8. МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ1 С
ДНКСУЬСТРАТОМ.
III. Экспериментальная часть
III. 1. Реактивы и материалы.
III.2. Методы.
1.2.1. Изучение связывания интегразы ВИЧ
с ДНКдуплексами
1.2.2. Изучение влияния модификаций 15субстрата на специфическую активность интегразы ВИЧ1.
1.2.3. Синтез дуплексов
с ковалентно связанными цепями
Выводы.
Литература


Впервые обнаружено, что в положениях субстрата с 5ого по 8ое ИН взаимодействует с непроцессируемой цепью субстрата в большей мере, чем с процессируемой. ИН в присутствии ионов 2, чем Мп2. Введение 2аминонуклеозидов в терминальные положения 5субстрата позволило нам получить аналог вирусной ДНК с ковалентно связанными на конце цепями. С использованием такого дуплекса показано, что расплетание цепей вирусной ДНК не является необходимым условием 3процессинга. В то же время, для эффективного Зпроцессинга ДНКсубстрата необходима дестабилизация пары АТ рядом с расщепляемой связью. Работа включает обзор литературы, посвященный строению и функциям интегразы ВИЧ1. Вирус иммунодефицита человека принадлежит к классу ретровирусов, и его репликативный цикл включает в себя стадию встраивания провирусной ДНК в ДНК зараженной клетки. Этот процесс осуществляется вирусным ферментом интегразой ИН. Известны два типа вируса иммунодефицита человека ВИЧ ВИЧ1 и ВИЧ2, которые незначительно отличаются друг от друга строением генома 9, . Интегразы обоих типов вируса очень близки по структуре и функциям, а поскольку ВИЧ1 является более патогенным и широко распространенным типом вируса, в дальнейшем мы будем рассматривать вопросы, касающиеся ИН именно ВИЧ1. ИН ВИЧ1 относят к семейству полинуклеотидилтрансфераз, в которое входят такие ферменты как транспозазы и ретровирусные ИН, а также РНКаза Н и резолваза v С , . Ферменты данного семейства катализируют процессы, приводящие к перемещению ДНК или ее фрагментов внутри генома, либо между геномами. Следует отметить, что данные процессы осуществляются без привлечения дополнительных источников энерши и, в конечном итоге, без изменения числа фосфодиэфирных связей. Кроме того, для ретровирусных интеграз характерно формирование очень устойчивых комплексов с ДНКсубстратом. Однако катализируемые ими реакции протекают без образования ковалентной связи между белком и ДНК . ИН ВИЧ1 осуществляет перенос молекулы ДНК вируса в геном зараженной клетки рис. Известно, что ИН узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3концов каждой цепи. Это первая стадия интеграции, она называется 3концевой процессинг. Далее ИН осуществляет перенос цепи встраивание укороченной вирусной ДНК в клеточную ДНК рис. Для осуществления 3концевого процессинга и переноса цепи ИН необходим кофактор i viv роль кофактора играют ионы , i vi реакции могут проходить также в присутствии ионов Мп2 . Помимо описанных выше двух реакций, i vi ИН способна катализировать еще одну, называемую дезинтеграцией . По существу она является обратной реакции интеграции. Рис. Интеграция ДНК ВИЧ1 в геном клетки. Дя осуществления стадии переноса цепи ИН необходимо связать сразу две молекулы ДНК вирусную и клеточную. Соответственно, встраиваемую вирусную ДНК называют субстратом ИН. ДНК мишенью. Взаимодействие ИН с ДНКсубстратом носит строго сиквенсспецифический характер, в то время как мишень связывается ферментом неспецифически. Все ретровирусные ИН высоко консервативны и обладают гомологией между собой, а также с множеством транспозаз . Рассмотрим строение ИН ВИЧ1. ИН ВИЧ1 содержит 8 аминокислотных остатков, и молекулярная масса фермента составляет кДа. Частичным протсолизом и направленным мутагенезом было показано, что в структуре фермента можно выделить три домена короткий Ыконцевой. Сконцевой, состоящий из аминокислотных остатков с 2 по 8 , , . Ыконцевой и каталитический домены содержат участки, характерные для всех ретровирусных интеграз. Сконцевой домен существенно менее консервативен. На рис. ИН и выделены несколько консервативных аминокислотных остатков в каждом домене. Рис. Схематическое изображение первичной структуры ИН. Показано, что для проведения реакций Зконцевого процессинга и переноса цепи необходимо наличие всех грех доменов, в го время как реакцию дезинтеграции может осуществить изолированный каталитический домен, и эффективность реакции в данном случае сравнима с эффективностью реакции, проводимой полным ферментом .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.190, запросов: 121