Изучение сигналузнающих частиц Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae: регуляция экспрессии и взаимодействие с рибосомой

Изучение сигналузнающих частиц Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae: регуляция экспрессии и взаимодействие с рибосомой

Автор: Ковальская, Ольга Николаевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2006

Место защиты: Москва

Количество страниц: 160 с. ил.

Артикул: 2977107

Автор: Ковальская, Ольга Николаевна

Стоимость: 250 руб.

Изучение сигналузнающих частиц Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae: регуляция экспрессии и взаимодействие с рибосомой  Изучение сигналузнающих частиц Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae: регуляция экспрессии и взаимодействие с рибосомой 

Содержание.
Ф Список сокращений.
Введение.
Обзор литературы
1. Строение и функция БЯР и ЭЯ из клеток животных
1.1. Структура 7БЬ РНК
1.2. Структура А1идомена БЯР.
1.3. Структура Бдомена БЯР.
1.4. Структура комплекса рибо сомасигнальный пептидБЯР.
1.5. Биогенез БЯР.
ф 1.6. Структура Б Я.
1.7. Структура комплекса рибосомасигнальный пептидБЯРБЯ
1.8. Функция БЯР и БЯ ранние исследования
1.9. Функция Б ЯР и БЯ сигнальные последовательности.
1 Функция БЯР и БЯ распределение функций между доменами БЯР .
1 Функция БЯР и БЯ арест трансляции
1 Функция БЯР и БЯ длина растущего пептида.
. . Функция БЯР и БЯ БЯР шаперон
1 Функция БЯР и БЯ БЯР и сигнальный пептид.
1 Функция БЯР и БЯ взаимодействие БЯР и БЯ, гидролиз СТР.
1 Функция БЯР и БЯ взаимодействие рибосомы и БЯ а
1 Функция БЯР и БЯ роль БЯ
1 Функция БЯР и БЯ дополнительная функция гетеродимера БЯР9БЯР
1 Функция БЯР и БЯ БЯР в посттрансляционном транспорте белков
2. Строение и функция 8ЯР и 8Я из клеток 8. сегемзае.
2.1. Структура 5СЯ1 РНК.
2.2. Структура А1идомена БЯР.
2.3. Структура Бдомена БЯР.
2.4. Биогенез БЯР.
2.5. Структура БЯ.
2.6. Функция БЯР и БЯ общие положения.
2.7. Функция 5 и БЯ нарушение генов компонентов БЯР.
3. Строение и функция 1Р и 1 из клеток Е. соИ
3.1. Структура ГЪ.
3.2. Структура 4.5Б РНК
3.3. Структура комплекса 4.5Б РНКЕЬМ.
3.4. Структура 7 У.
3.5. Структура комтекса
3.6. Функция БИР и БЯ ранние исследования.
3.7. Функция БЯР и БЯ взаимодействие РД с 4.5Б РНК.
3.8. Функция БЯР и БЯ общая схема работы Б ЯР бактерий
3.9. Функция БЯР и БЯ взаимодействие Б ЯР и БЯ, гидролиз СТР
ЗЛО. Функция БЯР и БЯ роль БесЛ.
3 Дополнительная функция 4.5Б РНК
4. Заключение
Результаты и обсуждение
1. Взаимодействие 8ИР с рибосомой Е. соИ.
1.1. Влияние остатков ЗтиоИ в составе 4.5Б РНК на образование
комплекса ЕИ6Н4.5Б РНК
1.2. Образование комплекса рибосомаРДбНЬтиоЗ. РНК, фотохимическое сшивание.
1.3. Изучение взаимодействия 4.5Б РНК срибосомными белками
1.4. Изучение взаимодействия 4.5Б РНК с Б и Б Ррнк
1.5. Определение остатков 4тиои в 4.5Б РНК, участвующих в образовании сшивок
1.6. Модель взаимодействия 4.5Б РНК с рибосомой
2. Влияние нарушения синтеза 8Яа на биосинтез компонентов 8ЯРпути
и на взаимодействие 8ИР с рибосомой в клетках 5. сегеушде
2.1. Создание штамма дрожжей с регулируемой экспрессией БЯа
2.2. Зависимость количества компонентов БЯРпути от количества БЯа
в клетке
2.3. Влияние нарушения синтеза БЯа на взаимодействие БЯР с рибосомой
3. Влияние нарушения синтеза Р1зУ на биосинтез белкового компонента 8ЯР в клетках Е. соИ
3.1. Создание бактериального штамма с регулируемой экспрессией белка
3.2. Зависимость количества i от количества в клетке.
Материалы и методы ш
Ф 1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды,
штаммы.
2. Клонирование.
2.1. Выделение плазмидной ДНК
2.2. Определение концентрации ДНК в растворе.
2.3. ПЦР.
2.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле
2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.
2.6. Приготовление векторов и вставок
2.7. Лигирование.
ф 2.8. Приготовление компетентных клеток . i.
2.9. Трансформация компетентных клеток . i.
2 Определение первичной структуры ДНК по Сэигеру.
3. Получение 4.5 РНК, определение соотношения тио в 4.5 РНК
3.1. Создание конструкции
3.2. Получение 4.5 РНК с помощью Т7транскрипции.
3.3. Определение соотношения 4тио1Ш в полученной 4.5 РНК.
4. Выделение белка 6i.
4.1. Создание конструкции 6i.
4.2. Выделение белка 6i на i агарозе
4.3. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ
ф 5. Образование комплекса 4.5 i6i
6. Получение мРНК лактамазы.
7. Трансляция мРНК лактамазы i vi, выделение транслирующих рибосом
7.1. Трансляция мРНК лактамазы i vi
7.2. Трансляция мРНК лактамазы i vi
7.3. Выделение транслирующих рибосом.
8. Фотохимическое сшивание комплекса 4.5 i6i с рибосомами
9. Анализ продуктов фотохимического сшивания.
9.1. Пошаговое центрифугирование.
9.2. Гидролиз 4.5 РНК, и рРНК с помощью рибоиуклеазы Н.
9.3. Гидролиз 4.5 РНК и фотоаддукта 4.5 РНК с рРНК с помощью рибонукпеазы Т
9.4. Анализ фотоаддуктов 4.5 РНК с рибосомными белками с помощью антител
. Создание дрожэсевых штаммов и .
.1. Получение ПЦРфрагмента I
.2. Трансформация клеток . vii.
.3. Выделение геномной ДНК . vii.
.4. ПЦР с геномной ДНК . vii.
.5. Иммунодетекция белка 4,5 в клетках . vii.
.6. Вестернблоттииг белков
. Детекция РНК и мРНК белков 4, , ,
а и субъедипиц , карбоксипептидазы
.1. Наращивание клеток . vii.
.2. Выделение суммарной РНК из клеток . vii методом
горячей фенольной депротеинизации.
.3. Приготовление зондов для нозернблотаиапиза.
.4. Нозернблотанализ РНК и мРНК белков 4, ,
, а и рсубъединнц , карбоксипептидазы
. Анализ количества белка 4,5 в клеточных фракциях . vii
. Создание штамма X
.1. Создание конструкции .
.2. Получение ПЦРфрагмента II.
.3. Трансформация клеток Х 3, содержащих плазмиду , ПЦРфрагментом II
. Вестернблотансииз белков и
Выводы
Список литературы


Уже в году с помощью электронной микроскопии было установлена пространственная структура это продолговатая частица размером нм в ширину и нм в длину . В составе можно выделить малый или и большой или домены, разделенные подвижным адаптером. Дальнейшее изучение структуры с использованием биохимических подходов и данных электронной микроскопии позволило определить основные участки взаимодействия 7 РНК и белков в составе . РНК и гетеродимером 9, домен содержит спирали 6, 7, 8 и частично 5 молекулы 7 РНК, а также белки , и гетеродимер рис. А . Миючсн . I Б
Рис. Б . РНК была обнаружена в составе довольно давно. Было показано, что поглощает свет с длиной волны А0 что характерно для нуклеиновых кислот. Обработка микрококковой нуклеазой приводит к разрезанию на два фрагмента с коэффициентами седиментации 5 и 8. Выделенная из молекула РНК имела коэффициент седиментации 7, и по первичной структуре совпала с обнаруженной ранее молекулой 7 РНК 2. РНК взаимодействует с белками в соотношении 2, . Более тщательное изучение при обработке микрококковой нуклеазой показало, что большая часть РНК покрыта белками и недоступна для разрезания нуклеазой. Первый разрез РНК происходит в определенном месте и не дает изменений в структуре и функции . Последующая обработка нуклеазой приводит к нарушению функции и к разделению на два домена и . Клонирование и биохимическое изучение молекул 7 РНК из других организмов , , дало возможность предположить вторичную структуру 7 РНК рис. РНК образует протяженные двойные спирали. Данная структура согласуется с результатами химической модификации 7 РНК . Спирали 3, 4 и часть спирали 5 вместе образуют структуру, схожую со структурой РНК. На сегодняшний день функция неизвестна . И6, Ь7, Ь8 и часть спирали 5. Эти данные хорошо согласуются со структурой 7 РНК, которую удалось наблюдать в составе в электронный микроскоп . Вторичная структура 7 РНК является высококонсервативной среди эукариот , . РсОАи о 0 . Пд ос. КГ Ч6Г. Э0АиО
и, ССО СОСООСССС АПСОАО С ООО осе бАССиСАСвОСАССОАОААв о воссосс ОООООАО СУАООСООО,. Рис. Вторичная структура 7БЬ РНК животных. РНК транскрибируется РНКполимеразой 1 , после транскрипции на Зконец навешивается дополнительный остаток аденина , . В работах П. Уолтера было показано, что белки 8ЯР9 и БИР по отдельности не проявляют РНКсвязывающей активности. Эти белки в отсутствии 7БЬ РНК образуют очень прочный гетеродимер, который способен затем связываться с РНК , . Связывание гетеродимера происходит с А1иучасгком Ь РНК, точнее с нуклеотидными остатками 1 так называемый 5А1идомен и с остатками и так называемый 3А1идомен , . Связывание осуществляется стехиометрически, с высокой аффинностью, независимо от других белков , , . С помощью сайтнаправленного мутагенеза было показано, что в обоих белках содержатся домены, важные для образования комплекса с РНК . Точечные мутации высококонсервативных нуклеотидных остатков в А1идомене Ь РНК нарушают образование комплекса гетеродимера 8ЯРРР с РНК . ЯР9 и БИР в порядке 8ЯРЯР или 9, разделенные линкером в аминокислотных остатков. Такой химерный белок способен структурно и функционально заменять гетеродимер 8РРРР . Рис. Кристаллическая структура химерного белка мыши, содержащего белки 8РР9 и в порядке 9, была получена с разрешением 2,5 А и была первой кристаллической структурой белков, входящих в А1идомен рис. Как оказалось, белки 8КР9 и структурно похожи друг на друга, оба содержат одинаковый структурный мотив аР3рх. В составе гетеродимера они образуют общий а непараллельный шеститяжевой рлист, на выпуклой стороне которого находятся четыре аспирали, а на вогнутой стороне расположены положительно заряженные аминокислотные остатки. Данная структура помогла смоделировать структуру гетеродимера со спиралью РНК . В году были получены две кристаллические структуры комплекса 8КРКР из клеток человека с А1иподобными участками РНК . Первая структура, полученная с разрешением 3,2 А, соответствовала комплексу 8КРКР с молекулой РНК длиной нуклеотидных остатков 8А, содержащей 5домен А1иучастка рис. Б, В.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.223, запросов: 121