Изучение взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК на примере мРНК гена MDR I человека. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их активности в культуре клеток

Изучение взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК на примере мРНК гена MDR I человека. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их активности в культуре клеток

Автор: Костенко, Елена Вячеславовна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2001

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 155 с. ил

Артикул: 2313084

Автор: Костенко, Елена Вячеславовна

Стоимость: 250 руб.

Изучение взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК на примере мРНК гена MDR I человека. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их активности в культуре клеток  Изучение взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК на примере мРНК гена MDR I человека. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их активности в культуре клеток 

Введение.
Глава 1. Молекулярные механизмы возникновения множественной лекарственной устойчивости и способы ее преодоления Обзор литературы
1.1. Множественная лекарственная устойчивость.
1.1.1. Основные механизмы, приводящие к снижению концентрации лекарственных препаратов в клетке
1. 1.1. 1. Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная
функционированием Ргликопротеина .
1.1.1. 2. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая белком
1. 1. 1. 3. Другие белки, участвующие в формировании фенотипа за счет снижения внутриклеточной концентрации цитостатиков.
1.1.2. Лекарственная устойчивость, обусловленная инактивацией химиопрепарата в клетке
1.1. 3. Лекарственная устойчивость, связанная с изменением клеточных мишеней препаратов или с активацией системы репарации
1. 1. 3. 1. Молекулярные механизмы возникновения устойчивости к ингибиторам топоизомераз.
1.1.4. Роль генов, контролирующих апоптоз, в формировании лекарственной устойчивости опухолевых клеток.
1.1.5. Клиническое значение различных типов . Множественность механизмов лекарственной устойчивости
1. 2. Количественное определение уровня лекарственной устойчивости опухолевых клеток
1. 2.1. Определение уровня экспрессии гена 1.
1. 2. 1.1. Оценка уровня мРНК
1.2.1.2. Оценка экспрессии Ргликопротеина.
1.2.1.3. Оценка функциональной активности Ргликопротеина
1.2. 1.4. Сравнительный анализ разных методов детекции экспрессии гена 1
1. 2. 2. Детекция экспрессии генов 1 и .
1. 3. Обращение фенотипа .
1. 3.1. Блокирование транспортной функции Ргликопротеина
1.3. 3. Избирательное уничтожение клеток, обладающих фенотипом . Генотерапевтические подходы к повышению пороговой дозы цитостатиков в химиотерапии.
1.3. 4. Обращение фенотипа путем подавления экспрессии гена 1 .
1. 3. 4.1. Использование антисмысловых олигонуклеотидов для обращения
фенотипа .
1. 3. 4. 2. Использование рибозимовдля обращения фенотипа
1. 3. 4 .3. Регуляция активности промотора гена
Глава 2. Изучение взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК на примере мРНК гена 1 человека. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов i vi и их активности в культуре клеток Результаты и обсуждение.
2.1. Выбор модели
2. 2. Идентификация в структуре 5концевого фрагмента 1 мРНК сайтовмишеней для антисмысловых олигонуклеотидов.
2. 2. 1. Клонирование бконцевой области 1 кДНК
2. 2. 2. Пробинг вторичной структуры бконцевого фрагмента мРНК гена
рибонуклеазами Т1, и V
2. 2. 3. Модель вторичной структуры бконцевого фрагмента мРНК гена 1 .
2. 2. 4. Выбор последовательностеймишеней для антисмысловых олигонуклеотидов.
2. 3. Исследование гибридизации антисмысловых олигонуклеотидов с i vi транскриптом 1 РНК.
2. 3.1. Дизайн флуоресцентно меченых олигонуклеотидных конъюгатов
2. 3. 2. Исследование гибридизации биспиренильных производных олигонуклеотидов АЬз Нь, с 8звенным i vi транскриптом 1 РНК
методом флуориметрического титрования
2. 3. 3. Исследование гибридизации олигонуклеотидов А Н с i vi транскриптом 1 РНК методом задержки в геле. Идентификация сайтов связывания
олигонуклеотидов А Н с 1 РНК.
2. 3. 4. Влияние биспиренильной группировки на термосгабильность комлексов
биспиренильных производных олигонуклеотидов с РНК и ДНК мишенями
2. 3. 4. Применение биспиренильных производных олигонуклеотидов для детекции ДНК в растворе.
2.4. Исследование активности антисмысловых олигонуклеотидов в культуре клеток.
2.4.1. Выбор клеточной линии
2.4. 2. Производные олигонуклеотидов, использованные для ингибирования
экспрессии 1 мРНК в клетках линии КВ
2. 4. 3. Выбор метода тестирования внутриклеточной активности олигонуклеотидов
2. 4. 4. Ингибирование экспрессии 1 мРНК в клетках КВ антисмысловыми олигонуклеотидами.
2. 4. 5. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов i vi и их активности в культуре клеток
Глава 3. Экспериментальная часть
3. 1. Материалы.
3.1. 1. Реактивы и препараты
3.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды
3.1. 3. Линии клеток
3.1.4. Олигонуклеотиды
3.1. 5. Буферные растворы, использованные в работе
3. 2. Методы
3. 2. 1. Приготовление компетентных клеток
3. 2. 2. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК.
3. 2. 3. Выделение плазмидной ДНК аналитический вариант.
3. 2. 4. Выделение плазмидной ДНК препаративный вариант.
3. 2. 5. Рестрикционный анализ плазмидных ДНК.
3. 2. 6. Выделение суммарной клеточной РНК
3. 2. 7. Клонирование фрагмента кДНК гена 1.
3. 2. 8. Синтез i vi транскрипта фрагмента РНК гена 1.
3. 2. 9. Пробинг вторичной структуры фрагмента 1 мРНК.
3. 2. . Праймернаправленная обратная транскрипция
3. 2 Компьютерное моделирование вторичной структуры фрагмента
3. 2. . Введение Рметки на 5конец олигонуклеотида
3. 2. . Синтез 5биспиренильных производных олигонуклеотидов.
3. 2. . Исследование гибридизации олигонуклеотидов с i vi транскриптом РНК гена 1 и контрольными ДНК и РНК матрицами методом флуориметрического
титрования.
3. 2. . Расчет термодинамических и кинетических констант связывания
олигонуклеотидов с РНК
3. 2. . Исследование гибридизации олигонуклеотидов с i vi транскриптом РНК
гена 1 методом задержки в геле
3. 2. . Пробинг дуплексов РНК олигонуклеотид РНКазой Н
3. 2. . Синтез 5биспиренильных3аминогексильных производных
олигонуклеотидов.
3. 2. . Измерение уровня экспрессии гена 1 в культивируемых клетках
методом ОТПЦР
3. 2. . Электофорез.
Список Литературы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей работе использованы следующие сокращения
2 Оптическое поглощение раствора на длине волны 0 нм
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК Рибонуклеиновая кислота
тРНК Транспортная рибонуклеиновая кислота
мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота
ПААГ Полиакриламидный гель
Трис Трисокиметиламинометан
Бычий сывороточный альбумин
Диэтилпирокарбонат
Дитиотреитол
Культуральная среда
Этилендиамимтетрауксусная кислота
Эмбриональная телячья сыворотка
глутатионЗтрансферазы
гидроксиэтил1пиперазинэгансульфокислота
, 5биспиренильные производные олигонуклетидов
X, 5биспиренильные3аминогексильные производные
олигонуклетидов Р, Неорганический пирофосфат
Фенотип Фенотип множественной лекарственной устойчивости
Фрагмент 1 РНК 8звенный i vi транскрипт 1 РНК
1 Ген множественной лекарственной устойчивости
I изопролилтиогалактопиранозид
Фосфатный солевой буфер
РдР Ргликолротеин, продукт гена
Фенотип , вызванный гилерэкспрессией гена
Додецилсульфат натрия
x 5бромо4хлоро3индолилргалактопиранозид
Гены человека обозначены прописными буквами, выделенными курсивом 1, , . Белки, кодируемые генами человека, обозначены прописными буквами , . Гены других организмов обозначены строчными буквами, выделенными курсивом , белки, кодируемые этими генами, обозначены строчными буквами
. Префикс при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклеотидных пар и мономерных звеньев для краткости описания опущен.
ВВЕДЕНИЕ


Выброс веществ из клеток связан с функционированием транспортных белков, к которым принадлежат Ргликопротеин РдР, транспортеры семейства , а также некоторые другие белки табл. Вскоре после обнаружения в году феномена множественной лекарственной устойчивости было показано, что активное выведение лекарственных препаратов из клеток, приводящее к снижению их внутриклеточной концентрации, может являться причиной возникновения фенотипа . В году в линии клеток, проявляющей кроссрезистентность к антрациклинам, винкаалкалоидам и актиномицину Д, был идентифицирован белок, названный Ргликопротеином РдР . Этот белок был вскоре обнаружен и в других клеточных линиях, обладающих фенотипом , . Клонирование и секвенирование кДНК, кодирующей Ргликопротеин, проведенное несколькими исследовательскими коллективами , позволило исследовать роль Ргликопротеина в приобретении клетками фенотипа . РдР в возникновении множественной лекарственной устойчивости. Приобретение клетками устойчивости к химиопрепаратам вследствие экспрессии Ргликопротеина было первым обнаруженным механизмом возникновения фенотипа . Поскольку позднее были обнаружены другие механизмы возникновения множественной лекарственной устойчивости клеток, фенотип , обусловленный экспрессией Ргликопротеина, был назван классическим. Таблица 3. РдР Ш. Среди разнообразных путей развития лекарственной устойчивости фенотип , обусловленный экспрессией РдР, является наиболее изученным. Классический фенотип РдР характеризуется нарушенной внутриклеточной аккумуляцией противоопухолевых препаратов вследствие функционирования Ргликопротеина энергозависимого трансмембранного насоса с широкой субстратной специфичностью 3, . Активность РдР определяет устойчивость опухолевых клеток к знтрациклинам, винкаалкалоидам, актиномицину Д и колхицину, но не сообщает им устойчивость к алкилирующим агентам мелфалану и антиметаболитам 5фторурацилу, метотрексату . Белки семейства состоят из высококонсервативных цитоплазматических связывающих доменов и гидрофобных трансмембранных доменов и используют энергию гидролиза АТР для транспорта как небольших ионов металлов и аминокислот, так и крупных молекул пептидов, сахаров, стероидов и антибиотиков. Ргликопротеин представляет собой белок с молекулярным весом 0 кДа, состоящий из аминокислотных остатков 3, , . Этот трансмембранный белок состоит из двух симметричных частей, каждая их которых содержит гидрофобный трансмембранный домен, аспираль которого пересекает плазматическую мембрану 6 раз, и гидрофильный цитоплазматический домен, содержащий сайт связывания АТР рис. Структура Ргликопротеина с разрешением 2. Трансмембранные сегменты белка участвуют в формировании тороидальной структуры диаметром нм, имеющей центральную полость диаметром 5 нм, которая представляет собой водный трансмембранный канал. Предполагаемая организация трансмембранных аспиралей Ргликопротеина представлена на рис. В белковом кольце, сформированном трансмембранными сегментами Ргликолротеина, предполагается наличие полостей отмечены стрелками на рис. Исследование структуры Ргликопротеина методом сшивок показало близость спиралей 6 и при формировании тороидальной структуры трансмембранного канала . Предложенная структура Ргликопротеина согласуется с предполагаемой моделью его функционирования и общим планом строения белков семейства. Полости, существующие в тороидальной структуре, сформированной трансмембранными сегментами, позволяют субстратам проникать внутрь водного канала белка из липидного бислоя мембраны. Многие мутации, затрагивающие субстратную специфичность Ргликопротеина, касаются аминокислотных остатков, входящих в состав аспиралей трансмембранных доменов белка, которые, как предполагается, формируют субстратсвязывающий центр . Одной из наиболее удивительных особенностей Ргликопротеина является его широкая субстратная специфичность. Преобладание остатков ароматических аминокислот 8 трансмембранных доменах Ргликопротеина и большой диаметр центральной поры может способствовать динамической субстатиндуцируемой реорганизации структуры трансмембранного канала, объясняющей широкую субстратную специфичность Ргликопротеина , .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.344, запросов: 121