Создание эффективных ингибиторов генной экспрессии на основе олигонуклеотидов с природным сахаро-фосфатным остовом

Создание эффективных ингибиторов генной экспрессии на основе олигонуклеотидов с природным сахаро-фосфатным остовом

Автор: Готтих, Марина Борисовна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2000

Место защиты: Москва

Количество страниц: 263 с. ил.

Артикул: 292577

Автор: Готтих, Марина Борисовна

Стоимость: 250 руб.

Создание эффективных ингибиторов генной экспрессии на основе олигонуклеотидов с природным сахаро-фосфатным остовом  Создание эффективных ингибиторов генной экспрессии на основе олигонуклеотидов с природным сахаро-фосфатным остовом 

ВВЕДЕНИЕ
I. ПРОБЛЕМЫ II ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ
ПОДАВЛЕНИЯ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ ОЬЮР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Принцип действия антисмысловых олигонуклеотидов.
1.1 1. Направления действия антисмысловых олигонуклеотидов.
1.1.2 Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов.
1.1.3. Свойства, необходимые антисмысловым олигонуклеотидам
1.2. Принципы химической модификации антисмысловых олигонуклеотидов.
1.2.1. Модификация межнухлеотидных групп
1.2.1.1. Тнофосфатные аналоги олигонуклеотидов
1.2.1.2. Мстилфосфонатныс аналоги олигонуклеотидов.
1.2 1.3. Амидофосфатные аналог и олигонуклеотидов.
1.2.1.4. Фосфотрюфнрные аналоги олигонукдеошдов.
1.2.2. Модификация углеводных остатков.
1.2.2.1. ОСол и го нуклеотиды
1.2 2.2. замещенные олигонуклеотиды.
1.2.3. Одновременная модификация углеводных остатков и
межмуклеотндных групп олигонуклеотидов.
1.2.3.1. Морфолнновые аналоги олигонуклеотидов.
1.2.3.2. Пептидные нуклеиновые кислоты.
.4. Модификация гетероциклических оснований
олигонуклеотидов.
1.2.5. Химерные олигонуклеотиды.
1.2.6. Модификация концевых группировок сахарофосфатного
остова.
1.2.6.1. Конькиаты олигонуклеотидов с ннтеркаляторами
1.2.6.2. Реакционноспособные производные олигонуклеотидов
1.2.6.3. Бинарные системы олигонуклеотидов
1.2 6 4 Производные олигонуклеотидов с гидрофобными
соединениями.
1.2.6.5. Производные олигонуклеотидов с пептидами
1.3. Фармакология ангнс.мысловых олигонуклеотидов.
1. Проникновение и внутриклеточное распределение
олшонуклеогидов в культуре клеток.
I 3.2 Проннкиовенне и распределение олигонуклеотидов в тканях
живых организмов.
I 3.3. Токсические эффекты олигонуклеотидов.
1.3.3 1 Метаболизм модифицированных олигонуклеотидов
1.3 3 2 Исспсиифичсскис взаимодействия олигонуклеотидов.
1.4. Системыносители для доставки олигонуклеотидов в клетку.
1.4.1. Пептидные конструкции для доставки олигонуклеотидов в
клетку.
1.4.2. Липосомы.
1.4 2.1. Анионные и неГгтральныс лнпосомы.
1.4 2.2. рНчувствительные липосомы.
1.4 2 3. Иммунолипосомы
1.4 2 4 Реиепторнаправленные лнпосомы.
1.4 2.5 Фузогснныс липосомы.
1.4.2.6 Катионные липосомы.
1.4.3. Наночасгицы.
I 4.4 Деидримерные носители полиамидоаминного типа
1.5. Механизм действия антпемыгловых олигонуклеотидов.
1.5.1. Гндролкз РНК в дуплексе с олигонуклеотидом РНКазой Н.
1.5.2. Блокирование процессинга РНК без участия РНКазы Н.
1.5 2.1. Ингибирование обратной транскрипции.
1.5.2.2. Ингибирование трансляции
1.5 2.3. Ингибирование созревания мРНК
1.5.2.4. Ингибирование процессинга РНК за счет взаимодействия
олигонуклеотида с се функционально значимыми структурными элементами
1.5.3. Место действия антисмыслогюго олигонуклеотида в клетке
1.6. Перспективы использования аншсмысловых
ол я гону кл сот идо в.
II. СОЗДАНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ ИНГИБИТОРОВ ГЕННОЙ
ЭКСПРЕССИИ НА ОСНОВЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПРИРОДНЫМ САХАРО ФОСФАТНЫМ ОСТОВОМ
ОБСУЖДЕНИ Е РЕЗУЛЬТАТОВ.
.1. Активация концевых фосфатных групп олигонуклеотидов в волной среде.
. Метод карбодиимидной конденсации
II I. 1.1. Конденсация мононуклеотидов с амино и
окснсоединеннями
II 1.1.2. Конденсация олигонуклеотидов с амино и
оксисоединениями
ИЛ. 1.3 Общая характеристика метода карбодиимидной
конденсации.
.1.2 Конденсация олигонуклеотидов с оксисоединениями,
индуцируемая бромцианом.
II. 1.2.1 Влияние природы буфера на активацию фосфатной
группы бромцианом.
II I 2.2. Изучение механизма активации фосфатной группы
методом ЯМРспектроскопии.
II. 1.2.3. Общая характеристика метода.
II 1.3. Фосфорилкрующие производные олигонуклеотидов.
.2. Получение антисмысловмх олигонуклеотидов, содержащих 3 кониевые ненуклеотндные руппировкн.
2.1. Получение производных олигонуклеотидов с
и ггеркал ятерами.
.2.2. Получение производных олигонуклеотидов с пептидами.
.2.3. Получение производных олигонуклеотидов с лкпофильными 7 соединениями.
.З. Конструирование антнсмысловых олнтонуклеогилов с
повышенной специфичностью взаимодействия с РНКмишенями и устойчивостью к ферментативному гидролизу.
3 1 Химерные антисмысловые олигонуклеотиды.
.3.1.1 Получение и гибридизационная способность химерных
ар олигонуклеотидов.
.3.1.2. Устойчивость химерных олигонуклеотидов к 4 нуклеазному гидролизу.
Н.3.1.3. Специфичность взаимодействия химерных б
олигонуклеотидов с РНКмишенью
II.3.1.4. Ингибирование трансляции мРНК онкогена ли цд
химерными олигонуклеотидами.
.3.2. Циклические антисмысловыс олигонуклеотиды
.3 2.1. Получение циклических олигонуклеотидов.
II 3.2,2. Изучение термической стабильности дуплексов.
образованных циклическими олигонуклеотидами
.3.2.3. Биологические свойства циклических олигонуклеотидов
.3.3. Псевдоциклнческие олигонуклеотиды.
.3.3.1. Подтверждение вторичной структуры псевдо 2 циклического олигонуклеотида
И 3.3.2. Взаимодействие псевдоциклического олигонуклеотида с
РНКмишенью и его гидролитическая устойчивость И.3.4 Олигонуклеотиды, формирующие внутримолекулярные
дуплексы.
3.4.1. Дизайн олигонуклеотидных конструкций.
.3 4,2. Изучение гибридизации структурированных
олигонуклеотидов с ДИК и РНКмишенями.
II 3.4.3. Гидролнз РНКматрнцы РКазой в составе дуплексов с
олигонуклеотидами
.3.4.4. Устойчивость олигонуклеотидов различной вторичной 9 структуры в биологических средах.
.4. Проникновение и внутриклеточное распределение 6 олигонуклеотидов в присутствии системносителей.
4.1 Сравнение эффективности использования различных
носителей лля транспорта олигонуклеотидов в клетки 4 2 Кинетика проникновения комплекса олигонуклеотида с б
дендримером в клетки.
II 4.3. Изучение влияния клеточною цикла на внуфнклеточное
распределение олш онуклеот ндов.
.5. Изучение кинетики гибридизации структурированных 6 олигонуклеотидов с мишснями ратной .мины.
.5.1. Дизайн олигонуклеотидов для изучения кинетики их 6 гибридизации с разными РНКматрицам и
.5.2. Изучение взаимодействия структурированных
олигонуклеотидов с разными матрицами.
.5.3. Гибридизация антисмыслового олигонуклеотида с РНК в 2 присутствии
.5.4 Исследование гибридизации структурированных
олигонуклеотидов с мРНК белка оболочки вируса i x viv.
.6. Изучение фармакологическою действия лншсммс.юиых 5 олнгонукмео гидов.
.6.1. Разработка тестсистемы для изучения биологического
действия антнсмысловых олигонуклеотидов.
.6.2 Изучение ингибирующего действия антнсмысловых
олигонуклеотидов.
II 6 2.1. Влияние структуры олигонуклеотида на эффективность
ингибирования.
.6.2.2. Влияние концентрации антисмыслового олигонуклеотида
на ингибирующее действие.
6.2.3. Зависимость величины ингибирующего действия
антисмыслового олигонуклеотида от эффективности его проникновения в клетку
.6 3. Изучение механизма действия антнсмысловых 6 олигонуклеотидов.
Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
IV. ВЫВОДЫ
V. Литература
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и Международного Союза биохимиков I, а также следующие обозначения
НК нуклеиновая кислота
АТР аденози5трифосфат
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
н.п нуклеотидные пары
УФспектр ультрафиолетовый спектр
ЯМР ядерный магнитный резонанс
м д. миллионные доли
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
МКХ мнкроколоночная хроматография
ПААТ полиакриламидный гель
Трис трисгидроксимстнламиномстаи
МЭС 2морфолиноэтансульфокислота
гндрокснэтнл1 пнперазинэтансульфокислота
ЭДТА этилепдиамнигетраацегат натрия
ЭДК 1 этилдн.метиламинопропилкарбоднимид
ХС ксилениианол
ВРВ бромфеноловый синий
I флуорссцсинизотиоционата изомер I
ДМ ЕМ культуральная среда,
альбумин бычьей сыворотки,
бычья сыворотка,
ингибитор протеаз детергент.
ВВЕДЕНИЕ


Пзонропилсодержашие триэфиры устойчивы к дейсгвню нуклеаз 2. Обнаруженная для этилсодержа ингх триэфирных аналогов способность превращаться в клетках в обычные фосфолиэфирные олигонуклеотиды легла в основу интенсивно разрабатываемого в последнее время подхода к получению проолигонуклсотилов, т с устойчивых к гидролизу в межклеточной среде соединений, способных эффективно проникать через цитоплазматическую мембрану и превращаться внутри клегки в фосфодиэфирные олигонуклеотиды 2 Прсдложсноиспользовать олигонуклеотиды, межнуклеотидные фосфатные группы которых содержат защитные Яацил2тиоэтильные группировки. Г 0Рч 0 оо
Рис. Схема удаления 5ация2тиозтильной группы под действием эстераз. Показано, что проолигонуклеотиды действительно способны проникать в клетки, достаточно устойчивы в плазме человека и мыши, а также в желудочном соке человека, в то же время при инкубации в экстракте клеток СЕМ они селективно гидролизуются до анионных фосфодиэфиров 2. Модификация углеводных остатков. Они болсс устойчивы к действию нуклеаз, чем их природные аналоги, но не могут вызывать гидролиз РК в образуемых ими дуплексах РНКазой Н 3, 4. Особенностью олигонуклеотидов является то, что образуемые ими дуплексы с РНК и ДНК имеют параллельную ориентацию цепей, а не антнмарадлсльную. Термическая стабильность ардунлексов близка к стабильностью соответствующих РРдуплексов 5, 6. Рис. В литературе приводится мало примеров ингибирующего действия аолнгонуклсотидов Очевидно, это связано с тем. РНК по механизму, включающему действие РНКазы Н, как тиофосфоаты. РНК с рсуляторньми белками путем образования очень стабильных комплексов, как 3Р5 фосфамиды К тому же они также плохо, как природные олнгонуклетиды проникают через клеточную мембрану. Тем не менее, используя аолигонуклеотмды, комплементарные кэп району РНК. Описано также ингибирование пролиферации ретровируса i, вызывающею лейкемию у мышей, в электропермиабилнзованных клетках с помощью аолиюнуклеотида, комлементарною сайгу фиксации затравки обратной транскриптазы В том случая, когда сродство олшнуклеотидов к РНКмншени какимлибо образом увеличено например за счет присоединения к ним молекул, стабилизирующих двойную спираль, эффективность их биологического действия возрастает. Так обнаружено, что аолнгонуклеотнл, содержащий остаток псоралсна. Одна из наиболее часто используемых в настоящее время модификаций сахарофосфатного остова анэ исмысловых олигонуклеотидов состоит в замене 2гидроксида рибонуклеотида на алкильный или алкоксильный остаток рис. Рис. Лформу спирали в дуплексах, образусмт. III. Т, образуемого дуплекса с комплемсарной РНК с 9С до 3С, для сравнения Т1Л РНКРНТС дуплекса такой же последовательности составляет 8С 1. Как и обычные рнбоолигонуклсотиды, 2замсщснныс олигонуклеотиды не вызывают гидролиз комлемеггарной цепи РНК РНКазой Н , но в отличие от нсмодифкиированных соединений они достаточно устойчивы к действию нуклсаз 2 Благодаря высокой стабильности их дуплексов с РНК, 2замещенные олигонуклеотиды могут ингибировать экспрессию РНК без участия РНКазы Н. Комплементарные точке сплайсинга мстилрибоолигонуклсотиды подавляют сплайсинг РНК т vi 3 Также i i они более эффективно и специфично, чем тиофосфаты, ингибируют трансляцию 4. В работе 5 проведено сравнительное исследование ингибирующей активности олигонуклеотидов с различными заместителями у 2атома углерода 2дезокси. Омегоксиэтил. Используемые олигонуклеотиды были комплементарны участку 5нстранслирусмой области и участку нуклеотидов кодирующей области мРИК вируса гепатита С. Ингибирующее действие замещенных олигонуклеотидов обнаружено также в исследованиях на животных. Так было проведено испытание противовирусной активности 2,,4дишпрофенильных аналогов олигонуклеотидов на мышах, инфицированных вирусом лейкемии мышеи 6 Мыши, обработанные олигонуклеотидами, не имели признаков заболевания, и не было обнаружено интеграции вирусного генома в ДНК. I Морфолиновые аналоги олигонуклеотидов. Эти соединения обладают необычной структурой, в которой дезоксирибоза заменена на остаток морфолина.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.195, запросов: 121