Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей

Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей

Автор: Бачева, Анна Владимировна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2002

Место защиты: Москва

Количество страниц: 154 с. ил

Артикул: 2293068

Автор: Бачева, Анна Владимировна

Стоимость: 250 руб.

Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей  Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей 

ВВЕДЕНИЕ
1. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОВАЛЕНТНО ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИН АЗ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
. 1. Характеристика ферментов, иммобилизованных на носителях с использованием диальдегидов.
1.2. Свойства сериновых протеиназ. иммобилизованных на эпоксисодержащих носителях
1.3. Иммобилизация сериновых протеиназ с использованием карбодиимидов
и свойства полученных биокатализаторов.
1.4. Иммобилизация сериновых протеиназ на носителях, активированных другими методами.
1.5. Сравнительная характеристика свойств сериновых протеиназ, иммобилизованных различными способами.
1.6. Сайтспецифическая иммобилизации сериновых протеиназ.
. 7. Получение и свойства биокомпозитов.
1.8. Поведение иммобилизованных ферментов средах, содержащих органические растворители.
1.9. Заключение.
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. Получение и характеристики комплекса ПАКсубтилизин
2.2. Стабильность комплекса ПАКсубтилизин в водных средах
2.3. Характеристика препаратов субтшизина, иммобилизованного
на криогеле поливинилового спирта
2.4. Стабильность иммобилизованного фермента в водных средах.
2.5. Стабильность нативного субтилизина в смесях органических растворителей с низким содержанием воды.
2.6. Стабильность комплекса ПАКсубтилизин в смесях органических растворителей с к изк г содержав нем воды.
2.7. Стабильность иммобилизованного субтилизина в смесях органических растворителе и
2.8. Синтетическая активность нативного, иммобилизованного субтилизина
и комплекса ПАКсубтилизин
2 9. Синтетическая активность нативного фермента
2. . Синтетическая активность комплекса ПАКсубтилизин
2. 1 1. Ферментативный синтез пептидов, катализируемый
иммобилизованным субтилизином.
2 Влияние активации ацилирующего компонента на ход синтеза
в органических растворителях.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы
3.1. Изучение ферментативных свойств нативного субтилизина, комплекса ПАКсубтилизин и иммобилизованного субтилизина в водных растворах
3.1.1. Измерение ферментативной активности субтилизина.
3.1.2. Получение, комплекса ПАКсубтилизин.
3.1.3. Определение активности комплекса ПАКсубтилизин.
3.1.4. Определение активности иммобилизованного субтилизина.
3.1.5. Титрование активных центров субтилизина. в водном буфере
3.1.6. Изучение стабильности субтилизина в водном буфере.
3.1.7. Изучение стабильности ПАКсубтилизииа. в водном буфере.
3.1.8. Изучение зависимости каталитической активности субтилизина
и комплекса ПАКсубтилизин от по гидролизу .
3.1.9. Изучение зависимости кинетических параметров субтилизина
и комплекса ПАКсубтилизин от по гидролизу .
3.1 Изучение стабильности иммобилизованного субтилизина
в водном буфере
3.2. Изучение ферментативных свойств нативного субтилизина, комплекса ПАКсубтилизин и иммобилизованного субтилизина в органических растворителях.
3.2.1 Суспендирование субтилизина.
3.2.2. Определение активности суспензии субтилизина.
3.2.3. Определение активности иммобилизованного и суспендированного субтилизина в ацетонитриле, содержащем 6.5 воды.
3.2.4. Изучение стабильности суспензии субтилизина в смесях органических растворителей.
3.2.5. Суспендирование комплекса ПАКсубтилизип.
3.2.6. Изучение стабильности суспензии комплекса ПАКсубтилизин в смесях органических растворителей.
3.2.7. Изучение стабильности иммобилизованного субтилизина в смесях органических растворителей.
3.2.8. Определение содержания воды в смесях органических растворителей
после инкубации с иммобилизованным субтилизином
3.3. Изучение синтетических свойств нативного субтилизина, комплекса ПАКсуотилизин и иммобилизованного субтилизина в органических растворителях.
3.3.1. Изучение синтетических свойств нативного субтилизина, суспендированного в органических растворителях.
3.3.1.1. Синтез А 1аА в смеси
ацетииитрило ДМФ5 воды.
3.3.1.1.1. Изучение зависимости синтеза А 1аАI от
содержав ия ДМФ.
3.3.1.1.2. Синтез в
смеси этанола ДМФ5 воды.
3.3.1.1.3. Изучение зависимости синтеза
от концентрации суспендированного субтилизина.
3 3.1.1.4. Изучение зависимости синтеза
от содержания воды в реакционной смеси.
3.3.1.2. Препаративный синтез .
3.3.1.3. Изучение влияния активации карбоксильной группы ацилирующего
компонента на ход синтеза I.
3.3.1.4. Синтез А в смеси 0ищетонитрил4ДМФ5 воды.
3.3.2. Изучение синтетических свойств комплекса ПАКсубтилизин,
суспендированного в органических растворителях.
3.3.2.1. Синтез в смеси
ацетопитрил ДМФ5 воды.
3.3.2.1.1. Изучение зависимости синтеза УА1аА1аЬеиРкер,А от
с одержан ия ДМ Ф. О
3.3.3. Изучение синтетических свойств иммобилизованного субтилизина
в органических растворителях.
3.3.3.1. Синтез УАаАаЬеиРерА в смеси ацетонитрил ДМФ. 1 З 3 3 1 I. Изучение зависимости синтеза УА1аА1аЬеиР1герА от
содержания ДМФ.
3.3.3.1.2. Изучение зависимости синтеза аЬеиРИерА от содержания ДМФ с одним образцом биокатализатора
и промывкой буфером
3.3.3.1.3. Многократный синтез аАаЬеиРерИА, катализируемый одним образцом иммобилизованного субтилизина в смеси
ацетонитрил ДМФ.
3.3.5.1.4. Изучение зависимости синтеза УАаАаЬеиРерА
от концентрации иммобилизованного субтилизина.
3.3.3.2. Изучение влияния активации карбоксильной группы ацилирующего
компонента на ход синтеза аАаеиРйерА.
3.3.3.3. Синтез УАаАауГерА в смеси ацетонитрил ДМФ.
3.3.3.4. Синтез У.АаА1аСчРерА в смеси ацетонитрил ДМФ.
3.3.3.5. Синтез УА 1аА 1ау.чА яррА в смеси ацетонитрил ДМФ.
5.5.3.6. Синтез УАаЛаСиАьррА в смеси ацетонитрил ДМФ.
3.3.3. 7. Синтез УА 1аА 1а.еиАзррМА в смеси ацетонитрил ДМФ.
3.3.3.8. Препаративный синтез УА1аАаЬу5АяррМА.
3.3.3.9. Синтез АЬАаАаРеРеА1аА1аОеО в смеси
ацетонитрил ДМФ.
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Найлон это непористая матрица, что, по мнению авторов, обеспечивает эффективность и высокую скорость взаимодействий субстрата с ферментом, связанным с поверхностью. Это свойство носителя является его главным преимуществом по сравнению с типичными пористыми или полупористыми иммобилизационными матрицами и, вероятно, может свести к минимуму диффузионные ограничения в проточных биореакторах с иммобилизованными ферментами. Для ковалентной иммобилизации ферментов на найлоне необходимо предварительно провести частичный кислотный гидролиз поверхности нейлона для генерации амино и карбоксильных групп, первые из которых можно присоединить к белкам при помощи глутарового альдегида рис. Рис. Схема иммобилизации ферментов на найлоне . Однако непористые матрицы обладают одним существенным недостатком невозможностью получения препаратов с высоким содержанием фермента. Так, в этой работе количество иммобилизованного фермента составляло, в среднем, 2 мгг носителя. Было исследовано влияние па каталитические свойства биокатализатора снейсерных молекул хитозана и полиэтиленимина ПЭИ как увеличивающих количество потенциальных связывающих центров , снижающих эффект микроокружения группировками матрицы и уменьшающих стерические затруднения. Показано, что для трипсина использование ПЭИ лучше, чем хитозана активность по гидролизу увеличивалась па при модификации носителя хитозана и на при использовании ПЭИ в качестве модификатора. Предложенный метод иммобилизации отличался трудоемкостью и насчитывал 8стадий. Каждую стадию необходимо было оптимизировать для получения максимального количества фермента на носителе . Для предотвращения неспецифического связывания фермента с матрицей применялась дополнительная стадия блокировки реакционных групп носителя смесью из 5 аминокислот , , , , или казеином, причем отмечается, что при использовании казеина количество связанного фермента уменьшаюсь. Значительные потери активности при хранении происходили за первые часов, которые авторы объясняют неустойчивостью альдиминной связи. Полученные препараты ферментов обладали средней стабильностью около сохранения активности в течение 2 недель 4С. Производные найлона6 поли екапролактамида, активированные глутаровым альдегидом, использовались в работе как носители для иммобилизации трипсина. Гранулы найлона6 солюбилизировали в муравьиной кислоте и переосаждали в двух различных нерастворяющих смесях вода и водаанетон , в результате получали губчатые производные и коллоидную суспензию. Максимальной активностью по азоказеину сразу после иммобилизации обладали препараты фермента, иммобилизованного на коллоиднодисперсном носителе 0, а активность трипсина, иммобилизованного на губчатом носителе, составляла . Наиболее стабильным оказался препарат фермента в виде губчатого производного сохранялось после 8 дней хранения при 4С и 7 циклов определения активности при С, в то время как остаточная активность других препаратов не превышала , причем основное падение активности, как и в работе , происходило в первые 2 дня инкубации. Поскольку количество иммобилизованного фермента не определяли, то полученные данные сложно сравнивать, тем не мснсе, наблюдалась похожая тенденция падения активности при хранении. Свойства химотрилсяна, ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта с использованием глутарового альдегида в качестве активирующего агента, описаны в работе . Носитель, полученный методом замерзанияоттаивания, обладал высокой пористостью при диаметре пор 0. Количество фермента, присоединенного к криоПВСГ, определенное по балансу оптической плотности растворов белка исходного и всех промывок, составило 1. Удельная активность иммобилизованного биокатализатора сосгавляла от исходной для нативного фермента по гидролизу ацегиламиномалоновой кислоты и . По мнению авторов, это свидетельствовало о том, что активный центр фермента в некоторой степени модифицировался в процессе иммобилизации. Одним из наиболее часто используемых кремнийсодержащих носителей является так называемое сгекло с контролируемым размером пор , .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.192, запросов: 121