Новые двухкомпонентные конструкции на основе ДНКзима 10-23

Новые двухкомпонентные конструкции на основе ДНКзима 10-23

Автор: Фокина, Алеся Анатольевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2008

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 191 с. ил.

Артикул: 4086082

Автор: Фокина, Алеся Анатольевна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
1. ДНКЗИМ КОНСТРУИРОВАНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .
1.1. Д1 ПСзим как каталитически активная нуклеиновая кислота
1.1.1. Роль ионов двухвалентных металлов в расщеплении РНК ДНКзимом
1.1.2. Кинетическая схема расщепления РНК ДНКзимом
1.2. Связь структуры ДНКзнма и его каталитической активности
1.2.1. Влияние последовательности оснований каталитического домена на активность ДНКзима
1.2.2. Зависимость каталитической активности ДНКзима от длины, последовательности и типа нуклео гидов субсгратсвязывающих участков
1.2.3. Регуляция каталитической активности ДНКзима при помощи его коныогирования с функциональными молекулами
1.2.4. Использование олигонуклеотидовэффекторов для регуляции каталитической активности ДНКзима
1.3. Применение ДНКзимов
1.3.1. Использование Д1 НСзимов для подавления экспрессии генов па уровне мРИК
1.3.1.1. Выбор участков РНК, доступных для расщепления ДНКзимами
1.3.1.2. Повышение устойчивости ДНКзима в биологических средах
1.3.1.3. Способы доставки ДНКзимов в клетки
1.3.1.4. Расщепление протяженных РНК i vi и ингибирование экспрессии генов i viv ДНКзимами
1.3.1.5. Сравнение биологической активности ДНКзима с другими антисснсагентами
1.3.2. Нетераиевтическое применение ДНКзимов
2. ЭКСПЕРИМЕЛПГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реактивы и приборы
2.2. Основные методы работы
2.3. Методики эксперимента
2.3.1. Выделение и анализ олигонуклеотидов
2.3.2. Получение фрагмента II мРНК крысы РНК4 транскрипцией i vi
2.3.3. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды
2.3.4. Введение радиоактивной метки в протяженные РНКтранскрипты
2.3.5. Расщепление синтетических фрагментов 1 мРНК РНК и РНК ДНКзимными конструкциями
2.3.6. Расщепление синтетических фрагментов II мРНК ДНКзимными конструкциями серий си. I1 и
2.3.7. Расщепление протяженных транскриптов 1 и II мРНК ДНКзимными конструкциями
2.3.8. Определение констант скорости ассоциации комплексов, образованных двухкомпонентным ДНКзимом или его отдельными компонентами с РНК4
2.3.9. Исследование расщепления РНК4 РНКазой Н в присутствии антисеисолигодезоксирибонуклеогидов и мутантных версий ДНКзимов
2.3 Исследование устойчивости ДНКзимов в культуральной срсдс с сывороткой
3. СОЗДАНИЕ ДВУХКОМПОНЕНТНЫХ ДНКзимов И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимных систем. Модельные двухкомпонентные ДНКзимныс конструкции и изучение их каталитической активности
3.1.1. Создание модельных систем двухкомпонентных ДНКзимов
3.1.2. Влияние строения олигонуклеотидовэффекторов на эффективность расщепления синтетического РИКсубстрата двухкомпонентными ДИКзимами
3.1.3. Влияние инвертированного тимидина на Зконце ДНКзима
на эффективность расщепления РНК двухкомпонентными конструкциями
3.2. Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена множественной лекарственной устойчивости 1
3.2.1. Выбор участка 1 мРНКтранскрипта для расщепления двухкомпонентными ДНКзимами. Создание двух компонентных систем для расщепления протяженного транскрипта 1 мРНК
3.2.2. Расщепление протяженного 0звснного структурированного
фрагмента 1 мРНК созданными двухкомпонентными ДНКзимами
3.3. Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена инсулиноподобного фактора роста II
3.3.1. Выбор участков.II мРНК для расщепления ДНКзимными конструкциями. Оптимизация длины субстратсвязывающих участков ДНКзимов.
Инозинсодержащие аналоги ДНКзимов
3.3.2. ДНКзимы для расщепления ЮР1 мРНК, содержащие модификации в
каталитическом коре и субстратсвязывающих участках
3.3.3. Расщепление протяженного транскрипта ЮР1 мРНК наиболее эффективными ДНКзимами
3.3.4. Конструирование двухкомпонентных ДНКзимов для расщепления ЮР1 мРНКтранскрипта и изучение кинетических аспектов связывания двухкомпонентной конструкции с РНК4
3.3.5. Расщепление ЮР1 мРНКтранскрипта двухкомпонентными ДНКзимами 8 ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Авторы работы кристаллизовали комплексы ДНКзима , содержащего октануклеотидные субстратсвязывающие участки, с иерасщепляемыми субстратами звенным олигодезоксирибонуклеотидом или химерным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим в сайте расщепления метилгуанозин и рибоцитидин. В подобранных условиях в присутствии мМ МС1г были получены кристаллы, отражающие, по мнению авторов, активную конформацию ДНКзимсубстратных комплексов, однако небольшой размер кристаллов не позволил расшифровать их структуру. С целью получения информации об активной структуре каталитического центра комплекса РНК ДНКзим было изучено влияние изменений нуклеотидной последовательности каталитического кора на активность ДНКзима . В работе авторы укорачивали различными способами нуклеотидный каталитический домен. Практически любое изменение длины каталитического кора приводило к снижению каталитической активности ДНКзима . Это свидетельствует о том, что составляющие кор дезоксирибонуклсотиды высококонсервативны. Интересно отметить, что в процессе этой работы авторами был получен новый Са2зависимый ДНКзим с нуклеотидным каталитическим доменом, имеющий практически такую же высокую каталитическую эффективность, как и ДНКзим . С целыо выявления нуклеотидов, которые непосредственно вовлечены в процесс катализа, авторы работы провели систематическое исследование влияния введения точечных мутаций в последовательность нуклсотидной петли на активность ДНКзима . Сначала была оценена степень консервативности каждого из дсзоксирибонуклеотидов. Результаты данного скрининга показали, что замена дезоксирибонуклсотидов С, , Т4, Об, вы на другой нуклеотид приводила к полной потере каталитической активности ДНКзима рис. Замена нуклеотидов в позициях 7 не влекла за собой серьезных изменений активности, причем Т8 оказался наименее консервативным по сравнению со всеми остальными нуклеотидами. Полученные данные согласуются с результатами, опубликованными в работах 1, 6, и позволяют заключить, что нуклеотиды в позициях 1 6 и , напрямую вовлечены в формирование каталитического центра ДНКзима рис. Рис. Определение консервативности нуклеотидов в каталитическом домене ДНКзима . Эффективность расщепления с представляет собой отношение ОА значения степени расщепления пт РНК мутантными версиями ДНКзима к значению степени расщепления немодифицированным аналогом, умноженное на 0 . Далее авторы работы выполнили серию последовательных замен каждого из нуклеотидов в каталитическом коре на дезоксиинозин с целыо получения информации о том, какие из экзоцикличсских функциональных рунп принимают непосредственное участие в катализе рис. Рис. С1 С2 СЗ Т4 А5 Об С7 Т8 А9 СЮ Л Л С С Л уМНОЖННО На 1 . Как видно из рис. ДНКзимов. Если ДНКзимные конструкции с дезоксиинозином были полностью неактивны, то ДНКзимы с дсзокснаденозином сохраняли частичную активность. Учитывая, что инозин отличается от аденозина отстствисм аминоруппы, можно сделать вывод о существенности для катализа бЫэкзоаминогруппы у нуклеотидов в позициях 3 и . При исследовании замен вб на дезоксиинозин и дезоксиаденозин оказалось, что наличие 2амино1руппы в данной позиции функционально не существенно, в то время как 6кетогруппа шрает существенную роль для катализа. Замены дезоксигуанозина в позиции на дезоксиинозин или 2аминопурин дсзоксирибозид, у которого отсутствует 6кстогрунпа, полностью инактивировали ДНКзим. Эти данные позволили сделать вывод о том, что и 2аминогруппа, и 6кстогруппа в позиции вовлечены в формирование каталитического центра ДНКзима. Рис. Модель каталитического домена ДНКзима , иллюстрирующая влияние последовательности оснований каталитического домена на активность ДНКзима. Вершкальные черты соответствуют водородным связям между комплементарными основаниями стрелкой указан сайт расщепления пунктирной линией обведены основания, которые наиболее вероятно вовлечены в формирование каталитического центра ДНКзима схематично представлены экзоциклические функциональные группы, требующиеся для процесса катализа. На основании полученных данных авторами была предложена модель каталитического домена ДНКзима , иллюстрирующая влияние последовательности оснований каталитического кора на активность ДНКзима рис. Ометил аналоги или удалены без существенной потери активности ДНКзима расщеплять РНК.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.246, запросов: 121