Катализаторы расщепления РНК-пептидилолигонуклеотиды и органические соединения, включающие основные аминокислоты и катионные структуры

Катализаторы расщепления РНК-пептидилолигонуклеотиды и органические соединения, включающие основные аминокислоты и катионные структуры

Автор: Миронова, Надежда Львовна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2003

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 151 с.

Артикул: 2343824

Автор: Миронова, Надежда Львовна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
1. ГЛАВА 1. ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСЩЕПЛЕНИЯ РНК ИСКУССТВЕННЫМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ВВЕДЕНИЕ
1.2. МЕХАНИЗМ РАСЩЕПЛЕНИЯ ФОСФОДИЭФИРНЫХ СВЯЗЕЙ В РНК
1.3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ФОСФОДИЭФИРНЫХ СВЯЗЕЙ В РНК К ГИДРОЛИЗУ
1.3.1. Факторы, способствующие индукции спонтанного расщепления фосфодиэфирных связей в РНК
1.3.2. Гидролиз олигорибонуклеотидов влияние последовательности
и длины
1.3.2.1. Влияние структуры РНК на стабильность фосфодиэфирных
связей в коротких синтетических олигонуклеотидах
1.3.2.2. Влияние оснований, фланкирующих фосфодиэфирную связь,
на ее стабильность
1.3.2.3. Стабильность фосфодиэфирных связей в синтетических
химерных олигонуклеотидах
1.3.3. Влияние функциональных групп гетероциклических оснований
на чувствительность фосфодизфирной связи к расщеплению
1.3.4. Стабильность биологически значимых молекул РНК
1.3.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Факторы, определяющие чувствительность фосфодиэфирных связей к расщеплению
1.4. РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК ИСКУССТВЕННЫМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ
НА ОСНОВЕ ПЕПТИДОВ
1.4.1. Природные пептиды, обладающие рибонуклеазной акивностью
1.4.2. Синтетически полипептиды, проявляющие рибонуклеазную
активность
1.4.3. Конъюгаты пептидов с молекулами, обладающими сродством
к структуре РНК
1.4.3.1. Конъюгаты ферментов и олигонуклеотидов
1.4.3.2. Конъюгаты коротких пептидов и интеркаляторов
1.4.3.3. Олигонуклеотидпептидные конъюгаты, обладающие рибонуклеазной активностью
1.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ГЛАВА 2. КАТАЛИЗАТОРЫ РАСЩЕПЛЕНИЯ РНКПЕПТИДИЛОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ОСНОВНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА РАСЩЕПЛЕНИЯ РНК ИСКУССТВЕННЫМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ НА ОСНОВЕ 1,4ДИАЗАБИЦИКЛО2.2.2ОКТАНА И ЛИЗИНА , НЕСУЩИМИ ОСТАТКИ ИМИДАЗОЛА
2.1.1. Анализ доменной структуры химических рибонуклеаз на основе конъюгатов 1,4диазабицикло2.2.2октана
2.1.2. Сравнение рибонуклеазной активности модельных и базовых рибонуклеаз
2.1.3. Механизм расщепления РНК искусственными рибонуклеазами и
2.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК С ПОМОЩЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДПЕПТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ
2.2.1. НАПРАВЛЕННОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК КОНЪЮГАТАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПЕПТИДОМ
2.2.1.1. Исследование взаимодействия конъюгата рер с тРНз
2.2.1.2. Рибонукпеазная активность пептидолигонуклеотидных конъюгатов
2.2.1.3. Обсуждение результатов по направленному расщеплению РНК олигонуклеотидпептидным конъюгатом
2.2.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК С ПОМОЩЬЮ КОНЪЮГАТОВ ПЕПТИДА И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ СО СЛУЧАЙНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ
2.2.2.1. Дизайн олигонуклеотидпептидных конъюгатов
2.2.2.2. РНК субстраты
2.2.2.3. Определение уровня рибонуклеазной активности и специфичности расщепления РНК олигонуклеотидпептидными конъюгатами
2.2.2.3.1. Расщепление синтетического олигорибонуклеотида олигонуклеотидпептидными конъюгатами рер4 и рер
2.2.2.3.2. Расщепление i vi транскрипта тРНз человека олигонуклеотидпептидными конъюгатами рер4, рер7 и рер
2.2.2.3.3. Определение специфичности расщепления IV1 РНК олигонуклеотидпептидными конъюгатами рер4, рер7 и рер
2.2.2.3.4. Определение специфичности расщепления природной и i vi транскрипта олигонуклеотидпептидными конъюгатами рер4 и рер
2.2.2.3.5. Влияние структуры РНК на специфичность гидролиза
2.2.2.4. Контроли специфичности
2.2.2.5. Исследование возможности комплементарных взаимодействий между РНК и олигонуклеотидами в составе конъюгатов
2.2.2.6. Определение кинетических параметров расщепления РНК олигонуклеотидпептидными конъюгатами рер4, рер7 и рер
2.2.2.6.1. Концентрационные зависимости расщепления РНК олигонуклеотидпептидными конъюгатами
2.2.2.6.2. Кинетика расщепления РНК олигонуклеотид
пептидными конъюгатами
2.2.2.6.2.1. Анализ кинетики расщепления олигорибонуклеотида
2.2.2.6.2.2. Анализ кинетики расщепления природных
РНКсубстратов
.2.6,3. Определение сродства олигонуклеотидпептидных
конъюгатов к РНК
2.2.2.7. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной
части конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК
2.2.2.8. Влияние длины пептидного остатка в составе конъюгатов
на эффективность и специфичность гидролиза
2.2.2.9. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК олигонуклеотидпептидными конъюгатами
2.2.2.9.1. Влияние ионов магния на специфичность и эффективность расщепления РНК олигонуклеотидпептидными конъюгатами
2.2.2.9.2. Влияние ионов одновалентных металлов на рибонуклеазную активность олигонуклеотидпептидных конъюгатов
2.2.2.9.3. Влияние температуры на эффективность расщепления РНК олигонуклеотидпептидными конъюгатами
2.2.2.9.4. Влияние денатурирующих агентов на рибонуклеазную
активность олигонуклеотидпептидных конъюгатов
2.2.2.9.5. Влияние ионных и неионных детергентов на рибонуклеазную активность олигонуклеотидпептидных конъюгатов
2.2.2 Механизм расщепления РНК олигонуклеотидпептидными
конъюгатами по X и РугАпоследовательностям
2.2 Природа специфичности олигонуклеотидпептидных
конъюгатов к последовательности
2.2 Влияние структуры конъюгатов на эффективность
расщепления РНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. МАТЕРИАЛЫ
3.1.1. Реактивы и препараты
3.1.2. Плазмиды
3.1.3. буферы и растворы, использованные в работе
3.2. МЕТОДЫ
3.2.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 3.2.2.Электрофорез в агарозном геле
3.2.3. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях
3.2.4. Приготовление растворов искусственных рибонуклеаз серии
3.2.5. Линеаризация плазмид , IV и
3.2.6. Получение i vi транскриптов РНК IV1 фрагмент длиной нуклеотидов, тРНКз человека и тРНК из дрожжей
3.2.7. Введение Рметки поЗОН группе тРНК
3.2.8. Введение Рметки в 5концевое положение РНК
3.2.9. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях
3.2 Расщепление РНК с помощью химических рибонуклеаз
серии
3.2 Расщепление динуклеозидмонофосфата СрА искусственными рибонуклеазами серии , и РНКазой А
3.2 Расщепление РНК с помощью олигонуклеотидпептидных
конъюгатов
3.2 Исследование связывания i vi транскрипта
3 с конъюгатом рер и олигонуклеотидом
3.2 Пробинг структуры v3 присутствии олигонуклеотида или олигонуклеотидпептидных конъюгатов рер4 и рер7 с
помощью РНКазы Т1
3.2 Пробинг структуры v3 комплексе с олигонуклеотидом
с помощью РНКазы Н
3.2 Исследование влияния концентрации солей на
гидролитическую активность олигонуклеотидпептидных конъюгатов
3.2 Исследование влияния температуры на гидролитическую
активность олигонуклеотидпептидного конъюгата
3.2 Определение Км и Vx
3.2 Определение оборотов реакции
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Таким образом, возникает проблема исследования чувствительности фосфодиэфирных связей в РНК к гидролизу для создания искусственных рибонуклеаз с разной специфичностью. В первой части данного обзора будут рассмотрены работы, посвященные исследованию чувствительности фосфодиэфирных связей к гидролизу. Вторая часть обзора посвящена искусственным рибонуклеазам, содержащем каталитический фрагмент на основе аминокислотных остатков, пептидов и пептидоподобных молекул. Известно несколько возможных механизмов расщепления фосфодиэфирных связи в нуклеиновых кислотах. Расщепление ДНК может протекать по механизму окислительного повреждения , по механизму фотоокисления , под действием радикалов, генерируемых различными реагентами ендиинами , природными и синтетическими антибиотиками , а также под действием алкилирующих реагентов, которые в результате модификации гетероциклических оснований приводят к выщеплению оснований по механизму элиминации и дальнейшему разрушению ДНК , . В отличие от ДНК, РНК проявляет значительно большую устойчивость к окислительному расщеплению, например, под действием металлонезависимых природных и синтетических антибиотиков, способных генерировать гидроксильные радикалы , поскольку гликозидная связь в рибонуклеотидах обладает большей стабильностью по сравнению с дезоксирибонуклеотидами. В отличие от ДНК, расщепление РНК протекает по гидролитическому механизму. Наличие в структуре РНК 2гидроксильных групп создает возможность расщепления фосфодиэфирных связей по механизму внутримолекулярной трансэтерификации. Расщепление РНК по этому механизму широко распространено в природе, например в реакциях, катализируемых природными рибонуклеазами и рибозимами. Доказано, что по этому же механизму происходит спонтанное расщепление фосфодиэфирных связей под действием слабых индукторов спермина, поливинилпиролидона , а также расщепление искусственными конструкциями на основе имидазола , остатков полизаряженных пептидов лизина и т. Механизм внутримолекулярной трансэтерификации включает несколько стадий. В нейтральных и кислых условиях дальнейшее превращение интермедиата может происходить двумя путями. В первом случае рис. Р0 происходит образование циклофосфата и высвобождение бнуклеозида. В качестве альтернативного пути может происходить псевдовращение связи вокруг атома фосфора, после чего эндоциклическая связь ЗОР претерпевает расщепление с образованием 2,5изомера исходного нуклеозида. Перенос уходящей группы является скоростьлимитирующей стадией некатализируемого спонтанного расщепления, которое происходит значительно медленнее, чем перенос фосфатной группы в отсутствие катализатора , . В щелочных условиях происходит депротонирование атакующего нуклеофила с последующим образованием пятивалентного переходного состояния фосфора рис. Образующийся интермедиат имеет слишком короткое время существования, для того чтобы претерпеть реакцию псевдовращения, поэтому не происходит переноса фосфатной группы в случае реакции, катализируемой основаниями, и реакция заканчивается образованием 2,3циклофосфата. В настоящее время накоплен большой материал по гидролизу РНК металлами и искусственными конструкциями, содержащими ионы различных металлов 2п2 , моноимидазольные конъюгаты с ионами 2 в качестве кофактора , , , Са2, Со2, Си, Мд2 Мп2 РЬ2, А, 1п3 макроциклические комплексы Ей , , тексафириновые комплексы с кофактором йу3 , . Некоторые из металлокомплексов способны вызывать расщепление связей в РНК в условиях, близких к физиологическим. На рис. РНК с участием ионов металлов. Выступая в качестве кислоты Льюиса, ионы металлов могут участвовать в каталитическом процессе, непосредственно взаимодействуя с кислородом фосфатной группы рис. Ионы металлов также могут принимать участие в катализе опосредовано координировать молекулу воды и выступать в роли внутримолекулярного общего кислотного катализатора рис. Рис. Расщепление фосфодиэфирной связи РНК по механизму внутримолекулярной трансэтерификации а расщепление в нейтральных и кислых условиях б расщепление в щелочных условиях . Ваве
он
б
1 . С у
в
Д
Рис. Расщепление фосфодиэфирных связей в РНК 8 присутствии ионов металлов .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.192, запросов: 121