Мостиковые олигонуклеотиды как перспективные инструменты в антисенс технологии и ДНК-диагностике

Мостиковые олигонуклеотиды как перспективные инструменты в антисенс технологии и ДНК-диагностике

Автор: Пышная, Инна Алексеевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2006

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 150 с. ил.

Артикул: 2869408

Автор: Пышная, Инна Алексеевна

Стоимость: 250 руб.

Введение
1. ВВЕДЕНИЕ
Использование олигонуклеотидыых конструкций в качестве инструментов для иа правленного воздействия на нуклеиновые кислоты НК, например, в антисенс техноло
гии или в медицинской ДНКдиагностике, основано на способности олигонуклеотидов образовывать прочные комплексы с комплементарными им участками НК. Основные требования к олигонуклеогидным конструкциям состоят в обеспечении высокой эффективности, сайтспецифичиости и селективности их связывания с комплементарными им участками НК.
Сайтспецифичность, как и эффективность связывания олигонуклеотида с комплементарной НК, определяется его длиной и нуклеотидной последовательностью и зависит от комплексообразующей способности этого олигонуклеотида, т.е. от стабильности формируемых им комплексов. Селективность олигонуклеотидных конструкций отражает их способность различать на уровне связывания ДНКмишени, содержащие несоответсгф вия в последовательности. Так, высокоэффективное связывание протяженного антисмы
слового олигонуклеотида может оказаться нсселективным, поскольку наряду с образованием прочного совершенного комплекса при физиологических условиях не исключена возможность формирования частично комплементарных комплексов с мишенями, содержащими нуклеотидные несоответствия в последовательности 1. Наиболее остро проблема обеспечения селективности комплексообразования встает для ССбогатых олигоиуклеотидных конструкций, когда стабильность ОСбогатых комплексов, содержащих мисматчи, оказывается близка или даже выше стабильности совершенных АТбогатых комплексов сопоставимой длины. Зависимость стабильности НКкомплсксов от иуклео гидного состава делает проблематичным использование при гибридизационном анализе
Ж наборов олигонуклеотидов равных по длине. В этом случае, при одинаковых условиях гибридизации, задаваемых форматом параллельного анализа, возможно появление ложноположитсльных или ложноотрицательных сигналов 2. Таким образом, создание олигонуклеотидных конструкций, способных высокоселективно связываться с НК, является важной и пока не решенной задачей как при разработке геннанравленных соединений, так и олигонуклеотидных зондов.
В настоящее время существуют несколько подходов к повышению селективности комплексообразования олигонуклеотидов введение в состав буфера тетраалкиламмониевых солей 3, которые способны частично нивелировать различия в связывании олигонуклеотидов разного нуклеотидного состава замена протяженных олигомеров танде
мами на основе коротких олигонуклеотидов 4 применение модифицированных олигонуклеотидов с измененными гибридизационными свойствами 5. В качестве последних широко представлены олигонуклеотидные аналоги с замещенным рибозофосфатным остовом, например, на основе пептидил 6 или замкнутых 7 нуклеиновых кислот, обладающие повышенными гибридизационными свойствами. Однако использование таких олигонуклеотидов ограничивается отсутствием строгого алгоритма для предварительного расчета стабильности образуемых ими комплексов как совершенных, так и содержащих мисматчи. Кроме того, комплексы таких олигонуклеотидов с НКмишенями не всегда могут выступать в качестве субстратов ферментов, часто используемых в различных молекулярнобиологических исследовашш.
Олигонуклеотиды, состоящие из нативных нуклеотидных блоков, соединенных ненуклеотидными вставками, и имеющие непрерывный сайт связывания с НК моетнковые олигонуклеотиды, могут быть компромиссным вариантом между протяженными и модифицированными олигонуклеотидами. Гибридизационные свойства таких мостиковых олигонуклеотидов могут поддаваться расчету, т.к. вставки не затрагивают способности оснований образовывать комплементарные пары, не нарушают геометрию спирали комплексов НК, а лишь локально возмущают структуру рибозофосфатного остова. Кроме того, выпетленная из двуцепочечной спирали нснуклеотидная вставка не должна существенно влиять на способность модифицированных комплексов выступать в качестве субстратов в ферментативных реакциях. Описаны олигонуклеотиды с различными ненуклеотидными вставками циклические 8 и шпилечные 9 известны дуплексы , триплексы и более сложные комплексы, олигонуклеотидные компоненты которых соединены вставками. Вставки являются инструментом, с помощью которого би или трикомпонентные процессы сводятся к монокомпонентным, упрощая исследования нуклеиновонуклеиновых взаимодействий , .
Цель и задачи исследовании. Целью настоящей работы являлось изучение возможности использования мостиковых олигонуклеотидов в качестве инструментов для ДНКдиагностики, основанной на методе молекулярной гибридизации в качестве олигонуклеотидных зондов, и для направленного воздействия на НК мишень в качестве адресной части алкилирующих производных.
В ходе исследования впервые решались следующие задачи
Введение


В связи с этим уделяется большое внимание разработке методов детекции нерадиоактивных репортерных групп. В литературе решение этой проблемы представлено двумя способами. В первом способе проводят образование гибридизационного комплекса и регистрацию сигнала гибридизации в режиме реального времени с помощью процесса резонансного переноса энергии флюоресценции . Этот метод основан на введении пары флюорофоров донора и акцептора энергии, по концам олигонуклеотида . Флюоресцентные группировки подбираются так, чтобы происходило частичное перекрывание спектра испускания одной группировки со спектром возбуждения другой. При возбуждении донорафлюорофора на соответствующей длине волны энергия может передаваться по дипольдипольному взаимодействию соседнему акцепторуфлюорофору, если он расположен на определенном расстоянии от донора. В результате происходит гашение флюоресценции донора и увеличение интенсивности флюоресценции акцептора. Обзор литературы циональна шестой степени расстояния между донором и акцептором . Максимальный перенос происходит на расстоянии А . Примером такой пары флюорофоров являются донор 6карбоксифлюоресцеин I и акцептор 6карбокситетраметилродамин II и их производные

На первых этапах применения для детекции гибридизации использовались модели, в которых по изменению интенсивности сигнала фиксировали образование гибридизационного комплекса, например, при гибридизации на НКматрице двух меченных флюоресцеином и родамином олигонуклеотидов рядом друг с другом . Следующим шагом в дизайне флюоресцентных зондов стало создание так называемых молекулярных маяков биконов олигонуклеотидов, образующих шпилечные структуры и несущих по концам остатки красителей, между которыми возможен перенос энергии. В качестве красителей для биконов могут быть использованы как пара флюорофорфлюорофор, так и пара флюорофортушитель . В случае пары флюорофорфлюорофор обеспечивается эффективное свечение акцепторной группировки в отсутствие НКматрицы . При внесении НКматрицы наблюдается изменение интенсивности сигнала флюоресценции , по которой судят об образовании гибридизационного комплекса НКзонд. Обзор литературы Для пары флюорофортушитель Р свечение зондабикона в свободном состоянии не регистрируется, поскольку красители подбираются таким образом, что энергия, полученная флюорофором сразу же передается тушителю, т. При внесении НКматрицы наблюдается разгарание сигнала флюоресценции , по которой судят об образовании гибридизационного комплекса НКзонд. Примером пары флюорофортушитель являются флюорофоры флюоресцеин I, родамин II, цианин III или x IV, и тушители дабцил V или 1 VI
Г
Применение тушителей считается достаточно перспективным, поскольку, например, один нефлюоресцентный хромофор, такой как дабцил или ВНС 1, способен служить универсальным тушителем сразу для большого количества флюорофоров. Однако, это достоинство приводит к проблеме одновременного возбуждения двух разных флюорофоров на разных длинах волн. Обзор литературы 2, присоединенные к донору через спейсер. Для обоих биконов свечение в свободном состоянии не регистрируется, поскольку энергия, полученная донором Р, сразу же поглощается тушителем 0, а не передается акцептору Я. При внесении НКматрицы, содержащей сайт связывания одного из биконов, наблюдается флюоресценция, по которой судят об образовании соответствующего гибридизационного комплекса . В качестве тушителя и донора энергии для таких биконов используются, например, остатки дабцила V и флюоресценна I, в качестве акцепторных остатков 1 и 2 тетраметилродамин II и x IV. В исследовательских работах при использовании метода , как правило, зонды, несущие остатки флюорофоров, применяются в недостатке по отношению к НКматрице, для того чтобы обеспечить полное связывание зондов с матрицами и, соответственно, обеспечить изменение интенсивности флюоресценции. Другой способ нерадиоактивной детекции гибридизационного комплекса в растворе описан в работе , в которой предложено использовать в качестве зондов производные олигонуклеотидов, содержащих по межнуклеотидному фосфату остаток интеркалятора акридина.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.195, запросов: 121