Синтез ингибиторов сульфатазы эстрона

Синтез ингибиторов сульфатазы эстрона

Автор: Глуздиков, Иван Александрович

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2007

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 211 с. ил.

Артикул: 3317379

Автор: Глуздиков, Иван Александрович

Стоимость: 250 руб.

Синтез ингибиторов сульфатазы эстрона  Синтез ингибиторов сульфатазы эстрона 



На основании предварительных данных о структуре и свойствах фермента была разработана и реализована многоступенчатая стратегия очистки сульфатазы эстрона из гомогената плаценты человека, позволившая выделить и охарактеризовать ее активную форму . На каждой стадии очистки наблюдался быстрый рост специфической активности ЕСТ, что подтверждает функциональную целостность фермента. Основываясь на полученных данных об активности очищенной сульфатазы эстрона, ее
содержание в плаценте предполагая, что в ней не содержатся ингибиторы Е
СТ было оценено в . Молекулярная масса очищенного фермента составила кДа, что находится в хорошем соответствии с массой мономерной формы, полученной в результате клонирования . Сульфатазную активность по отношению к Е и ДЭАС измеряли радиометрически, используя в качестве субстратов меченые тритием сульфаты эстрона и дегидроэпиадростерона. Для этого 1 мл смеси, содержащей меченый субстрат НДЭАС или 6,НЕ8, в концентрации от 1. М инкубировали с подходящим количеством фермента в буфере ТрисНС1 0 мМ, 8. С. Реакция останавливали добавлением к инкубируемой смеси ледяного раствора карбоната натрия 1 мл, 0. Смесь встряхивали в течение секунд и центрифугировали. Органическую фазу отделяли и анализировали содержание меченых тритием гидролизованных стероидов с помощью жидкостного сцинцилляционного спектрометра . Подобный анализ проводили на каждой стадии очистки сульфатазы эстрона, от тканевого гомогената до чистого фермента, при различных концентрациях субстрата. Во всех случаях наблюдалась линейная зависимость образования продукта гидролиза от времени инкубирования 2 мин, С . В опытах с предварительно дезактивированным ферментом нагревание при 0С, мин не наблюдалось образования продукта гидролиза за время инкубирования. Данные кинетических экспериментов были проанализированы в координатах ЛайнувераБерка рис. Е8 Км . М, Утах 9. Мминмг белка для гидролиза ДЭАС Км 9. М, Утах 1. Мминмг белка. Отношение скоростей гидролиза измеряли на каждой стадии очистки сульфатазы эстрона, оно составило в среднем 5. Е1С, гак и ДЭАС . Получение пригодных для такого исследования кристаллов белковых молекул, а тем более ферментов, которые были ассоциированы с мембраной, в активной форме представляет собой сложную задачу. Авторы работы испробовали около 0 различных условий кристаллизации, имея лишь мг чистой сульфатазы эстрона, прежде чем удалось получить кристаллы приемлемого размера и качества. Часть кристаллов была растворена, молекулярная масса фермента, входящего в кристалл, составила около кДа, а специфическая активность от не кристаллизованного, следовательно в кристалле присутствует полноцепочечный фермент в активной форме. По данным рентгеноструктурного анализа, третичная структура сульфатазы эстрона образована двумя доменами рис. Рис. Больший по размеру полярный домен состоит из двух субдоменов. Субдомен 1 СД1 образован ю аспиралями 1, 2,4, , которые разделены рскладчатыми областями, ограничен по краям ю аспиралями и и включает в себя каталитическую область рис. Субдомен 2 СД2 состоит из 0 аминокислотных остатков с Сконца молекулы, формирующих 4 антипараллельные Рскладки и аспирапь . Две аспирали 8 и 9, трансмембранного домена ТД, выступают из практически сферического полярного домена, придавая молекуле форму гриба рис. Было проведено сравнение сульфатазы эстрона и двух известных, цитозольных сульфатаз человека арилсульфатаз А и В , . Аминокислотная последовательность сульфатазы эстрона гомологична последовательностям арилсульфатаз А и В на и соответственно. Наиболее консервативной областью оказался полярный субдомен 1, схожий по форме и размеру у всех трех сульфатаз. ЕСТ, прежде всего наличие высоко гидрофобного трансмембранного домена, а также значительные вставки, делеции и замены аминокислот, особенно в Сконцевом субдомене 2, который участвует во взаимодействии полярного домена с поверхностью мембраны . Две антипараллельные спирали 8 и 9 рис. А рис. Обе спирали образованы преимущественно гидрофобными аминокислотами и тесно ассоциированы друг с другом за счет гидрофобных взаимодействий боковых цепей лейцина, изолейцина, валина, аланина и фенилаланина.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.192, запросов: 121