Исследование структуры комплекса эндонуклеазы рестрикции EcoRII с ДНК с помощью биохимических и спектральных методов

Исследование структуры комплекса эндонуклеазы рестрикции EcoRII с ДНК с помощью биохимических и спектральных методов

Автор: Субач, Федор Васильевич

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2005

Место защиты: Москва

Количество страниц: 142 с. ил.

Артикул: 2830901

Автор: Субач, Федор Васильевич

Стоимость: 250 руб.

Исследование структуры комплекса эндонуклеазы рестрикции EcoRII с ДНК с помощью биохимических и спектральных методов  Исследование структуры комплекса эндонуклеазы рестрикции EcoRII с ДНК с помощью биохимических и спектральных методов 

ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ЭР ТИПА Н И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭР ТИПА НЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Методы изучения ЭР типа II
1.1.1. Кинетический подход
1.1.1.1. Методы регистрации расщепления ДНК
1.1.1.2. Стационарная кинетика гидролиза
1.1 Однооборотная кинетика гидролиза ДНК
1.1.1.4. Влияние условий на кинетику расщепления ДНК ЭР.
1.1.1.5. Классификация ЭР типа II согласно их кинетическим механизмам расщепления ДНК
1.1.2. Использование модифицированных субстратов для изучения контактов,
образуемых ЭР с ДНК.
1.1.2.1. Модификация гетероциклических оснований
1.1.2.1.1. Классификация модификаций
1.1.2.1.2. Энергетическая оценка ДНКбелковых взаимодействий в терминах теории переходного состояния
1.1.2.1.3. Факторы, которые необходимо учитывать при определении ДИК
белковых контактов.
1.1.2.1.4. Наиболее охарактеризованные модификации
1.1.2.1.5. Мало охарактеризованные модификации
1.1.2.1.6. Определение контактов со стороны белка, с помощью модифицированных аналогов субстрата.
1.1.2.2. Модификация углеводофосфатного остова
1.1.2.2.1. Статистическое алкилированис или футпринтинг.
1.1.2.2.2. Межнуклеотидная тиофосфатная Рь группа
1 Аффинная модификация ЭР типа II.
1.1.3.1. Зондирование ДНКбелковых контактов
1.1.3.1.1. 5Иодо2дезоксиуридин 5 и 5иодо2дезоксицитидин 5МС.
1.1.3.1.2. 5бромо2,дезоксиуридин 5Вгс1и.
1.1.3.1.3. 6тио2дезоксигуанозин сг и 4тио2дезокситимиднн сТ.
1.1.3.1.4. Азидофенацильная группа
1.1.3.1.5. Замещнная пирофосфатная группа ЗПГ
1.1.3.1.6. Диальдегидная группа.
1.1.3.2. Определение механизма действия ЭР типа II с помощью аффинной модификации ЭР или модификации ЭР низкомолекулярными бифункциональными реагентами
1.1.4. Использование спектроскопических методов для изучения ЭР типа II.
1.2. Сравнительный анализ ЭР типа НЕ
1.2.1. Структурная организация
1.2.2. Гомология с другими ферментами.
Ф 1.2.3. Механизм гидролиза ДНК
1.2.3.1. Критерии двухсайтового механизма действия ЭР.
1.2.3.2. Число гидролизуемых связей.
1.2 Зависимость гидролиза от длины односайтового субстрата
1.2.3.4. Цис и яясвзаимодействия.
1.2.2.5. Механизм транслокации
1.2.2.6. Кинетические модели гидролиза ДНК
ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ЕСОШ1С ДНК С ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ И СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
2.1. Зондирование контактов эндонуклеазы ЕсоЯП с фосфатными группами ДНК
2.1.1. ДНКдунлсксы, содержащие модифицированные углеводные остатки
2.1.2. ДНКдунлексы, содержащие межнуклеотидную хиральную тиофосфатную группу.
2.1.2.1. Синтез и хроматографическое разделение Кр и 5диастереомеров звенных олигонуклеотидов
2.1.2.2. Получение звснных олигонуклеотидов, содержащих хиральную тиофосфатную группу, с помощью хроматографического разделения звенных олигонуклеотидов и последующего ферментативного лигирования.
2.1 Определение конфигурации тиофосфатной группы
2.1.2.4. Гидролиз эндонуклеазой ЕсоШ ДНКдуплексов, содержащих в участке узнавания ЕсоШ1 тиофосфатную группу
2.1.3. Зондирование контактов эндонуклеазы ЕсоКН с группами атомов ДНК,
расположенными в малой бороздке, с помощью ДНКдуплексов, содержащих остатки или н7аноатмбензо1а1пиренаХ2сЮ
2.2. Идентификация участка эндонуклеазы .II, взаимодействующего с центральной нуклеотидной парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации.
2.3. Изучение структуры комплекса К.ЕсоЯИДНК с помощью флуоресценции
.1. Взаиморасположение участков узнавания ЕсоКП в комплексе ЮБсоКПДИК.
.1.1. 7раслокализация участков узнавания
.1.2. молокализации участков узнавания.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .
3.1. Материалы.
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
.1. Выделение Н.ЕсоШ1
3.3.2. Хроматографическое разделение р и Лрдиастсреомеров олигонуклеотидов и определение их конфигурации.
3.3.3. бФосфорнлнрование олигонуклеотидов.
3.3.4. Ферментативное лигирование.
3.3.5. Выделение олигонуклеотидов из геля
3.3.6. Гидролиз ДНКдуплексов эндонуклеазой ЕсоШ
3.3.7. Разделение и диастереомсров олигонуклеотидов, содержащих остаток ,трансантиВаРГОсЮ
3.3.8. Получение ДНК методом ПЦР.
.9. Комилсксообразование ЭР ЕсоШ с ДНК.
3.3 Фотоаффинная модификация ЭР ЕсоШ сШсодержацими ДНКдуплексами. 4 Гидролиз ковалентных конъюгатов протсолитическими ферментами с
последующей очисткой и анализом
3.3 Измерение переноса энергии и расчет геометрии петли ДНК.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ аденозин5трифосфат а.о. аминокислотный остаток БСА бычий сывороточный альбумин ВРВ бромфеноловый синий
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
гуанидингидрохлорид
ДДС додсцилсульфат натрия
ДТТ 1,4дитиотреитол
ед. акт. единица активности
ИБК оиодозобензойная кислота
5I остаток 5иод2дезоксиуридина
КД круговой дихроизм
КЦ ксиленцианол
Сднк концентрация ДНК или ДНКдуплекса .ii концентрация эндонуклеазы II МСанализ массспектрометрический анализ МЭ 2меркаптоэтанол
I вариант массспектрометрии, основанный на ионизации методом лазерной матричной десорбции ixi i iii
I вариант времяпролтной массспектрометрии, основанный на ионизации методом лазерной матричной десорбции ixi i iii ii
I вариант тандемной массспсктромстрии, основанный на ионизации методом лазерной матричной десорбции ixi i iii ii
п.п. нуклеотидная пара
нуклеотидный остаток
оптическая единица
ОН олигонуклеотид
ОИпептид олигонуклеотидопептид
ГТААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
К.ЕсоЯИ эндонуклеаза рестрикции .II
РМ рестрикциямодификация
РСА рентгеноструктурный анализ
Трис трисгидроксимстиламииометан
Тпл температура плавления
УФспектр ультрафиолетовый спектр
ФДЭ фосфодиэстераза змеиного яда
ФМ фотоаффинная модификация ФМСФ фенилметансульфонилфторид ЭР эндонуклеаза рестрикции ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
Для обозначения нуклеотидов, аминокислотных остатков, олиго и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии ШРАС и Международного союза биохимиков ШВ.
ВВЕДЕНИЕ


В случае ЭР типа II пристальное внимание было уделено изучению кинетики гидролиза ЭР различных форм ДНК синтетических ДНКдуплексов, протяженных линейных ДНК, плазмидных ДНК и катснановых ДНК рслаксированной и суперскрученной форм. Методы регистрации расщепления ДНК. Расщепление синтетических ДНКдуплексов. Существует ряд методов детекции реакции расщепления ДНКдуплексов ЭР, обычно, длиной 8 н. Легкость детекции реакции гидролиза ДНК ЭР является одним из аргументов в пользу их использования в качестве модельных систем для изучения ДНКбелковых взаимодействий. Обычно осуществляют гидролиз 5Рфосфорилированных ДНКдуплексов реже вводят Рметку по 3концу ДНК с помощью фрагмента Клнова и Рас1АТР , 2. Радиоактивно меченные продукты гидролиза отделяют от исходной ДНК с помощью гельэлектрофореза в ПААГс 2 или с помощью хроматографии на ЭЕАЕцеллюлозе с последующей визуализацией радиоактивности с помощью радиоавтографии или фосфоримиджера, и детекцией радиоактивного счета по Черенкову. За гидролизом ДНКдуплексов можно следить и но 8мсткс, включенной в состав ДНКдуплсксов . В отличие от предыдущего метода визуализация более слабого ризлучения Б осуществляется с помощью флюорографии с использованием сцинтиллятора салицилата натрия. Отделение продуктов расщепления ДНК от исходной ДНК осуществляют также с помощью ВЭЖХ ,. Детекцию осуществляют по поглощению при нм. Но этот метод требует больших количеств вещества. В другом методе детекции гидролиза ДНК, позволяющем анализировать одновременно большое число образцов, в ДНК вводится на один 5конец биотин, а на другой 5конец антигенная группа или флуоресцирующий краситель Схема 1 . После проведения реакции гидролиза ДНК непрорсагировавшая ДНК и продукты гидролиза, содержащие биотин, связываются на плашках, покрытых авидином. Продукты гидролиза, не содержащие биотин, отмываются с плашек. Количество непрореагировавшей ДНК на плашке определяют с помощью иммуносорбентного анализа если ДНК содержит в качестве метки антиген или по интенсивности флуоресценции если ДНК содержит флуоресцирующую метку. За реакцией расщепления ДНК в непрерывном режиме можно следить с помощью УФспсктроскопии ,. Этот метод основан на гиперхромном эффекте. В процессе гидролиза ДИКдуплсксов обычно , звенных, устойчивых при температуре ферментативной реакции, образуются более короткие ДНКдуплексы, Та7 которых ниже температуры реакции гидролиза. Поэтому в процессе ферментативной реакции происходит образование одноцепочечных продуктов гидролиза, поглощение которых при 0 нм больше, чем исходных ДНКдуплексов за счет гиперхромого эффекта. По увеличению поглощения при 0 нм следят за реакцией гидролиза. За реакцией расщепления ДНК в непрерывном режиме возможно также следить и по уменьшению в результате плавления продуктов гидролиза переноса энергии возбуждения флуоресценции между красителями донором производные флуоресцеина и акцептором производные родамина, ковалентно присоединенными к 5концам противоположных цепей ДНКдуплексов, длиной н. За реакцией расщепления ДНК в непрерывном режиме следят и по разгоранию флуоресценции . В процессе гидролиза ДНК, содержащей 6карбоксифлуорссцеин 6РАМ или карбокситетраметилродамин ТАМКА, флуоресценция которых потушена расположенным рядом производным диметиламинофенилазобензолсульфоновой кислоты ЭАВСУЬ, в результате плавления коротких продуктов гидролиза происходит разгорание флуоресценции, которое легко регистрируется. Расщепление плазмидной ДНК Альтернативный путь изучения кинетики расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции представляет изучение гидролиза протяженной плазмидной ДНК. Гидролиз одной из цепей закрытой формы супсрскручснной кольцевой ДНК приводит к образованию открытой формы кольцевой ДНК, тогда как расщепление обеих цепей приводит к образованию линейной ДНК. Три формы обычно разделяют с помощью гельэлектрофореза в агарозном геле. Нерадиоактивную ДНК в геле регистрируют с помощью прокрашивания этидий бромидом, а ДНК, меченную радиоактивным тритием, регистрируют путем флюорографии с использованием сцинтилляторов .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.219, запросов: 121