Структурно-функциональное исследование роли домена IV элонгационного фактора G и спирали 34 16S рРНК в процессе транслокации на рибосомах Escherichia coli

Структурно-функциональное исследование роли домена IV элонгационного фактора G и спирали 34 16S рРНК в процессе транслокации на рибосомах Escherichia coli

Автор: Кубаренко, Андрей Валериевич

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2003

Место защиты: Москва

Количество страниц: 143 с. ил

Артикул: 2619443

Автор: Кубаренко, Андрей Валериевич

Стоимость: 250 руб.

Содержание
Список сокращений.
Введение
I. Обзор литературы.
I. Сбелки и ГТФазы трансляции
1А.1. Общие свойства вбелков
1А.1.1. Структура вТР связывающего центра Э домена.
1А.1.2. Механизм активации гидролиза ОТР
1А.1.3. Цикл работы ГТФазы.
1А.2. Факторы трансляции
1А.2.1. ЕРТи.
1А.2.3.1Р
1А.2.4. РРЗ.
1А.2.5. Роль гидролиза вТР и освобождения Р, в функционировании факторов трансляции.
1А.2.6. Активация ГТФазы факторов трансляции при взаимодействии с рибосомой .
I.З. Заключение
I. Транслокация и элонгационный фактор С
I.1. Механизм действия ЕРв и гидролиз вТР в процессе транслокации.
1В.2. Расположение ЕРС на рибосоме.
1В.З. Структурные изменения ЕРС и рибосомы в процессе транслокации.
1В.4. Роль спирали в транслокации
Цели работы
II. Результаты и обсуждение
НА. Сайтспецифическое сшивание ЕРС с рибосомой.
НА.1. Места введения фотоаффинного реагента в ЕРв
ИА.2. Модификация фотоаффинным реагентом
ИА.З. Проверка функциональной активности модифицированного фактора
НА.4. Формирование рибосомных комплексов с модифицированным ЕРв
ИА.5. Анализ сшивок радиоактивно меченного ЕРв.
ИА.6. Применение иммунологических методов для анализа продуктов фотохимического сшивания.
НА.7. Заключение
ИВ. Мутации в спирали рРНК.
II.1. Выбор мест введения мутаций в рРНК
II.2. Введение мутаций в рРНК мутагенез.
ИВ.З. Д7 штамм для экспрессии мутантных рРНК МС0.
II.4. Измерение времени удвоения клеток.
II.5. Выделение рибосом и проблема диссоциации рибосом
I1.6. анализ наличия мутаций в рРНК и определение чистоты популяции рибосом.
II.7. Зависимость степени диссоциации рибосом от концентрации Мд
II.8. Инициация и зависимость эффективности инициации от концентрации Мд2
II.8.1. Инициация при 7 мМ Мд2.
ИВ.8.2. Зависимость выхода образования инициаторного комплекса от концентрации Мд2.
II.9. Эффективность связывания аатРНК с А участком рибосомы и образования претранслокационного комплекса
II Связывание с А участком рибосомы аатРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном.
II Влияние мутаций на весь процесс функционирования в процессе транслокации стационарная кинетика
ИВ. . Метод престационарной кинетики остановленного потока и оборудование для него
ИВ1. Устройство установки для проведения кинетических экспериментов методом остановленного потока.
II2. Профлавин флуоресцентная метка в тРНКрг.
ИВ. . Престационарная кинетика связывания аатРНК с А участком рибосомы
II Престационарная кинетика элементарного акта транслокации.
ИВ. Определение точности трансляции i viv.
II Пробинг рРНК.
ИВ1. Химический пробинг всей последовательности рРНК.
ИВ2. Пробинг рРНК в инициаторном комплексе.
II. Заключение.
НС. Протонированные основания в рРНК
II.1. Роль протонированных нуклеотидов рРНК в пептидилтрансферазной реакции и катализе гидролиза на
II.2. Боргидридный метод определения заряженных оснований в РНК
ИС.З. Пара СН1
ИС.4. Нуклеотид А
II.4. Заключение.
III. Материалы и методы.
III. Сайтспецифическое сшивание с рибосомой.
III.1. Создание конструкции для экспресии гена
III.2. Выделение и очистка .
III.3. Модификация фотоаффинным реагентом
III.4. Формирование комплекса с рибосомой
III.4.1. Постгранслокационный комплекс с тиострептоном
III.4.2. Фосфорилирование в рибосомном комплексе.
III.5. Разделение модифицированных компонентов рибосомы.
III.6. Анализ продуктов фотохимической модификации с помощью антител
III. Мутации в спирали рРНК
III.1. Трансформация клеток ii i
III. 1.1. Получение компетентных клеток.
III.1.2. Трансформация
III.2. Введение мутации в рРНК мутагенез по методу Кункеля
III.3. Создание А7 штаммов МС0 и V9, несущих мутированный рибосомный оперон на плазмиде xxxx.
III.4. Измерение времени удвоения клеток
III.5. Стандартная методика выделения рибосом.
III.6. Выделение рибосом при повышенной концентрации 2.
III.7. Проверка наличия мутации в рибосомной РНК анализ
III.7.1. Выделение рибосомной РНК.
III.7.2. Реакция обратной транскрипции
III.8. Определение зависимости степени ассоциации рибосомных субчастиц от концентрации
III.9. Образование инициаторных комплексов
III.9.1. Стандартные условия 7 мМ
III.9.2. Формирование инициаторных комплексов при различной концентрации
III Определение константы скорости траслокации в единичном акте транслокации престационарная кинетика, метод остановленного потока
III1. Формирование претраслокационного комплекса с профлавинированной .
III2. Получение кинетических кривых метод остановленного потока
III Определение каталитической константы в многократном акте транслокации стационарная кинетика
1II1. Формирование претраслокационного комплекса
III2. Получение кинетических кривых.
III Анализ образования дипептида
1НВ Кинетика связывания тройного комплекса ЕРТиН1СТР4СРЬетРНКРлвР1 с А участком рибосомы престационарная кинетика, метод остановленного потока
ШВ1. Формирование тройного комплекса в профлавинированнойтРНК0.
ШВ2. Формирование инициаторного комплекса
III3. Получение кинетических кривых .
III Определение точности трасляции i viv.
III1. Получение штаммов МС7, содержащих плазмиду xxxx
III2. Определение активности ргалактозидазы.
III Химический пробинг рибосомных субчастиц, рибосом, рибосомных комплексов и анализ модификаций
III1. Реактивы, растворы и буферы
III2. Модификация
I1I3. Модификация кетоксалем.
III4. Модификация СМСТ.
III5. Выделение суммарной рибосомной РНК.
III6. Реакция обратной транскрипции
I. Протонированные основания в рРНК
III.1. Модификация РНК боргидридом натрия.
III.2. Реакция обратной транскрипции
IV. Выводы.
Список литературы


Карбоксильная группа 9 образует водородные связи с группами гуанина, а протоны амидных групп 6 и 7 стабилизируют участок связывания нуклеотида посредством образования водородных связей с остатками и петли 1. Петля 5. Аминокислоты белка , находящиеся между цепью и спиралью а5, взаимодействуют с нуклеотидом, в основном опосредованно, путем стабилизации структуры за счет образования водородных с связей остатками 6 и 9 в петле 4. Поскольку эта петля имеет только один непосредственный контакт с через амидную группу А1а6, сложно выделить какуюто консенсусную последовательность для всего семейства ГТФаз. Петля 5, вероятно, консервативна для всех малых кДа эукариотических ГТФаз, о чем свидетельствует консенсусная последовательность , где О гидрофобная аминокислота. Кандидатов на роль петли 5 можно найти и в аминокислотных последовательностях других ГТФаз. В аналогичная петля консервативна для нескольких гомологичных факторов и имеет консенсусную последовательность 3 в ii i. I.1. Важный шаг к пониманию механизма гидролиза был сделан в лаборатории Виттингофера с получением кристаллов и решением структуры комплекса с разрешением 1. А . В данной структуре остаток образует контакты с молекулой воды, расположенной таким образом, что может осуществлять нуклеофильную атаку на уфосфат . Данный факт позволил предположить механизм катализа гидролиза с участием . Было предложено два механизма участия белкаактиватора в катализе гидролиз . Первый механизм предполагает, что предоставляет какуюто свою группу в активный центр белка . В соответствии со вторым механизмом вызывает изменение конформации белка , в результате которой правильно позиционируется в каталитическом центре . Этот механизм основан на экспериментах с использованием , флуоресцентного аналога , степень флуоресценции которого изменяется при конформационных перестройках в активном центре белка . Анализ мутаций в активном центре белка показал, что замена на другие аминокислоты уменьшает скорость гидролиза , но не в той степени, которая ожидалась, если основываться на исключительной роли этого основания . Теоретические расчеты свободных энергий групп в активном центре белка показали, что глютамин, который является очень слабым основанием в водных растворах, в условиях активного центра выступает как еще более слабое основание, и образующиеся переходное состояние ОН является крайне нестабильным . Дальнейшие расчеты показали, что наиболее вероятным основанием в катализе является сам уфосфат , т. Это заключение также было подтверждено экспериментальными данными. Напрямую определенная с помощью ЯМР рКа уфосфата в составляет 2. Ка активной группы составляет 2. Более того, не было обнаружено существенных различий в механизме гидролиза как свободным белком , так и комплексом , . Таким образом, роль состоит в стабилизации переходного состояния и снижении энергетического барьера, следствием чего является увеличение скорости гидролиза. Прорыв в понимании детального механизма участия в стабилизации переходного состояния реакции гидролиза был связан с определением пространственных структур различных подобных белков и асубчастицы гетеротримерных белков . Соответствующие комплексы получали при связывании I или трифторида алюминия в активном центре белка в форме. В этих структурах ион 4 или трифторид алюминия связывается на месте уфосфата . Образующийся комплекс, как полагают, представляет собой переходное состояние гидролиза . На рисунке I. I АР4 домен человеческого белка 1, катализирующий ГТФазную активность белка и схематическое изображение контактов групп в активном центре Б . ЗОН группа рибозы взаимодействует с гидроксилом остатка треонина 5. Фторид алюминия I3 ориентирован так, что атомы фтора контактируют с ионом магния Мд2 группой , Vгруппой и МН2группой . В активном центре так же находится принципиально важный для катализа протонированный положительно заряженный остаток аргинина 9 рисунок I. А.2Б. В этом же наиболее консервативном районе белка находится еще один остаток аргинина, Агд3, который тоже важен для катализа .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.183, запросов: 121