Протеиназы как катализаторы реакций сегментной конденсации пептидов

Протеиназы как катализаторы реакций сегментной конденсации пептидов

Автор: Филиппова, Ирина Юрьевна

Шифр специальности: 02.00.10

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2002

Место защиты: Москва

Количество страниц: 241 с. ил

Артикул: 2303814

Автор: Филиппова, Ирина Юрьевна

Стоимость: 250 руб.

Протеиназы как катализаторы реакций сегментной конденсации пептидов  Протеиназы как катализаторы реакций сегментной конденсации пептидов 

ВВЕДЕНИЕ I
ГЛАВА 1. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРОТЕИНАЗ В РЕАКЦИЯХ ГИДРОЛИЗАСИНТЕЗА ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие принципы ферментативного синтеза пептидов
1.2. Пепсин. Характеристика и бнокаталитнчсские свойства
1.2.1. Стюение молекулы
1.2.2. Механихи действия
1.2.3. Специфичность в реакциях гидролиза пептидных связей
1.2.4. Применение в пептидном синтезе
1.2.5. Специфичность в реакциях синтеза пептидов
1.2.6. Заключение
1.3. Субтмлнтин. Харакчерист ика к биокаталшнческие свойства
1.3.1. Строение молекулы
1.3.2. Активный центр и механизм катазиза
1.3.3. Зона связывания субстрата и специфичность
1.3.4. Поведение в органических растворителях
1.3.5. Пептидный синтез в органических растворителях
1.3.6. Заключение
1.4. Тиолсубтнлнзнн и субтилигаза. Характеристика и
биокашли гнческие свойства
1.4.1. Получение тиолсубтияизина
. 4.2. Катал итические свойства и механизм действия тиолсубтичизина
1.4.3. Каталитические свойства субтичигазы
. 4.4. Использование тиолсубтичизина в пептидном синтезе
. 4.5. Использование субтилигазы в пептидном синтезе
1.4.6. Заключение
ГЛАВА 2. ПРОТЕИНАЗЫ КАТАЛИЗАТОРЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЮ СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ
2.1. Пепсин в реакциях сегментной конденсации пептидов
2.1. 1. Выбор модельной системы для оценки каталитической
активности
2.1.2. Пепсин как катализатор синтеза пептидов различного строения
в водноорганической среде
2.1.3. Изучение пепсина в реакциях сегментной конденсации пептидов
в органической среде
2.1.4. Пепсин как катализатор синтеза пептидов в концентрированных растворах мочевины
2.1.5. Заключение
2.2. Тнолсубтнлнзнн в реакциях сегментной конденсации пептидов
2.2.1. Получение и свойства тиоясубтилизина
2.2.2. Гиолсубтилизин как катализатор синтеза различных пептидов
2.2.3. Заключение
2.3. Субтилкшн в реакциях сегментной конденсации пептидов в органической среде
2.3.1. Поведение нативного субтитзина в полярных органических
растворителях
2.3.2 Немодифицированный субтшизин как катализатор синтеза пептидов в ацетонитриле
2.3.3 .Активность и стабильность субтилизина. ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта
2.3.4. Иммобилизованный субтшизин как катализатор синтеза
пептидов в органических средах
2.3.5. Получение и свойства комплекса БОЭсубтилизин
2.3.6. БОБсубтилизин в реакциях сегментной конденсации пептидов
в органических средах
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ КАТАЛИЗА ПРОТЕИН АЗАМИ РЕАКЦИЙ СЕГМЕНТНОЙ КОНДЕНСАЦИИ ПЕПТИДОВ
3.1. Влияние количества фермента на эффективность сегментной конденсации пептидов
3.1.1. Проблема соосаждения пепсина с образующимся продуктам
синтеза в водноорганических средах
3.1.2. Побочные реакции и соосаждение субтилизина в органических растворителях
3.1.3 Оценка количества фермента при проведении реакции сегментной конденсации пептидов
3.2. Влияние денатурирующих агентов на эффективность ферментативной сегментпой конденсации пептидов
3.2.1 Изучение закономерностей поведения пепсина в реакциях
сегментной конденсации пептидов к присутствии денатурирующих агентов
3.2.2. Влияние денатурирующих агентов на ферментативный синтез пептидов, кактатзируемый термолизином и субтилизином
3.3. Влияние органических растворителей на бмокагалнгнческис свойства протениат в реакциях сегментной конденсации пептидов на примере субтгингшна
3.3.1. Влияние количества воды
3.3.2. Влияние содержания димстилформамида
3.3.3 Влияние структуры ацичирующего компонента на протекание синтеза
3.3.4. Синтез пептидов, содержащих остатки пояифункционаяьных
аминокислот, под действие модифицированного субтилизина
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА СЕГМЕНТНОЙ КОНДЕНСАЦИИ ПЕПТИДОВ НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ СУБТИЛИЗИНА
4.1. Выбор носителя
4.2. Выбор спсйсера
4.3. Изучение эффективности конденсации пептидов на твердой фате
4.3.1. В 7 ияние структуры спейсера и его нагрузки на носитель
4.3.2. Влияние концентрации фермента и времени реакции
4.4. Ступенчатая конденсация пептидных блоков на аминосилохромс
4.5. Отщепление пептидов от твердого носителя
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТИВНЫХ МЕТОДОВ СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ПРОТЕИНАЗАМИ
5.1. Препаративный синтез олигопептндов
5.1.1. Синтез ди и трипептидов
5. . 2. Синтез эфиров и пнитроанилидов тетрапептидов
5.1.3. Синтез эфиров и пнитроанилидов пента и гексапептидов
5.1.4.Синтез эфиров опта и декапептидов
5.2. Синтез хромоснньх н флуорогенимх субстратов протсиназ
5.2.1. Хромогенные субстраты сериновых протеиназ
5.2.2. Хромогенные субстраты тиоловых и аспартилъных протеина
5.2.3 Флуорогенные субстраты аспартилъных протеиназ
5.2.4. Флуорогенные субстраты метагюпротеиназ
ГЛАВА 6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
6.1. Материалы н методы
6.2. Ферментативный синтез, катализируемый пепсином
6.2.1. Синтез эфиров пептидов в водноорганической среде
6.2.2. Синтез пнитроамшидов пептидов в водноорганической среде
6.2.3. Синтез пептидов в органической среде
6.2.4. Синтез пептидов в концентрированных растворах мочевины
6.3. Сегментная конденсация пептидов, кактализируемая нативным и модифицированным субтилизином
6.3.1. Получение и выделение тиаясубтилтина
6.3.2. Характеристика препарата тиолсубтияизина
6.3.3. Тиолсубтияизин как катализатор синтеза пептидов
6.3.4. Ферментативные свойства нативного субтияизина в органических средах
6.3.5. Синтез пептидов, катализируемых суспензией субтияизина в органических растворителях
6.3.6 Изучение ферментативных свойств субтияизина.
иммобилизованного на криогеле ЛВС
6.3.7. Синтез пнитроанияидов тетрапептидов, катаяизируемый иимобияизованиым субтияизином
6.3.8. Получение компяекса 8убтшизин
6.3.9. Солюбилизация компяекса 5ОЗсубтилизин в органических растворителях I
6 3. Определение активности компяекса ЯОЯсубтияизин в
органических растворителях
6.3 Синтез пептидов под действием компяекса ЗОЗсубтилизин
6.4. Соосаждение пепсина с продуктами синтеза пептидов
6.4.1. Измерение активности пепсина в процессе синтеза
6.4.2. Соосаждение лизоцииа в процессе синтеза, катая тируемого пепсином
6.4.3. Соосаждение белков в момент образования осадков пептидов
6.5. Синтез пептидов, катализируемый высококонцетприроваиной суспензией субтилизина в ацетонитрилс
6.5.1. Конденсация 2А1аА1аОМе и 1.еирКА
6.5.2. Конденсация 2А1аА1аОМе и ПРЪерКА
6.5.3. Конденсация 7А1аА1аОМе и НРЬеИНг
6.6. Влияние денатурирующих агентов на эффективность сегментной конденсации пептидов
6.6.1. Определение активности пепсина в присутствии денатурирующих
агентов
6. 6.2. Определение активности пепсина в ходе синтеза
6.6.3. Гидролиз I. пепсином в растворе, содержащем 8М мочевину
6.6.4. Определение активности термолизина в растворах, содержащих денатурирующие агенты
6.6.5. Синтез пептидов, катализируемый термолизином в присутствии мочевины
6.6.6. Определение активности субппаизина в растворах, содержащих денатурирующие агенты
6.6.7. Синтез пептидов, катализируемыйсубтшизином в присутствии мочевины
6.7. Влияние органических растворителей на ферментативные свойства протеина в реакциях синтеза пептидов
6.7.1. Влияние воды на эффективность синтеза 1аАI
6.7.2. Влияние концентрации диметилформамида на эффективность синтеза
6.7.3. Влияние количества субтилизина на эффективность синтеза
6.7.4. Влияние структуры ацияирующего компонента на ход синтеза I I
6.8. Синтез пептидов, содержащих в Рг и положениях полифункииональные аминокислоты
6.8.1. Синтез пептидов под действием комплекса субтичизин
6.8.2. Синтез пептидов под действием иммобилизованного субтилизина
6.9. Сегментная конденсация пептидов на амнносилохроме, катализируемая субтнлнзином
6.9.1. Присоединение пептидовспейсеров к аминосичохрому
6.9.2. Изучение ферментативной конденсации пептидов на аминосилохроме
6 9.3 Ступенчатая конденсация пептидных фрагментов на
аминосилохроме
6.9.4. Отщепление содержащих пептидов от аииносилохрома
6 Препаратнвный синтез пептидов, катализируемый иротснназамм
. Синтез ди и трипептидов
. Синтез тетрапептидов
. Синтез эфиров и пнитроаничидов пента и гексапептидов
. Синтез эфиров окта и декапептидов
6 Препаративный синтез хромогенных и флуорогенных пептидных субстратов
. Синтез хромогенных субстратов сериновых протеиназ
. Синтез хромогенных субстратов тиоловых и аспартичьных протеиназ
. Синтез ф.чуорогенных субстратов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Я5РЬсРЬс0Ме 0, 0. Пепсин относится к протеиназам с довольно широкой специфичностью из проанализированных пептидных связей фермент расщепляет то есть, вероя тность гидролиза любой пептидной связи составляет 0,8 ,. Первичная специфичность пепсина определяется взаимодействием Эр и 5подцентров зоны связывания фермента с аминокислотными остатками субстрата, образующими гидролизуемую связь Рр и Рположения. Как показывают данные рентгеноструктурного анализа, Бизона пепсина довольно значительна по размерам и прикрывается клапаном, в котором остатки Туг и ТЬг взаимодействуют с субстратом, образуя с ним несколько водородных связей и ван,черваальсовых контактов. Поскольку 8подцснтр связывания пепсина формируется в основном остатками гидрофобных аминокислот Не, РЬс, Тут, 1. I, наиболее предпочтительными в Р1положении субстрата являются РЬе, Ьеи, Тгр, Тут. МеС Па основе статистического анализа эффективности гидролиза пепсином различных белковых субстратов как благоприятный в Р1 положении приводится остаток и , . Вероятно, это связано с тем. В реакциях расщепления синтетических субстратов, как и при гидролизе белков, в положении Р наиболее благоприятны остатки , Туг, Тгр ,. V 1 8. Эта петля формирует клапан, который также может взаимодействовать с субстратом. V, , Не таблица 1, поэтому специфичности пепсина в положении Р удовлетворяют гидрофобные аминокислотные остатки Тгр, , , I ,,,. Однако, несмотря на гидрофобный характер i и подцентров в зоне связывания пепсина, наличие в них аминокислотных остатков, способных к образованию водородных связей , в и Тут 9, 3 в i таблица 1, делает возможным расщепление i. В первую очередь, это относится к протеолнзу белковых субстратов, многоцентровое связывание которых позволяет сгладить непродуктивные взаимодействия аминокислотных остатков субстрата, недостаточно соответствующих специфичности пепсина. Так, например, в окисленной рибонуклеазе А пепсин гидролизует связи А1аА1а, , , . Туг, , , . Тгр происходит очень медленно, а связи , . Большое влияние на эффективность гидролиза оказывают вторичные взаимодействия, обусловленные связыванием субстрата с 2, 3 и Ягподцснграми. Вследствие этого аминокислоты с ароматическими радикалами в белковых субстратах редко оказываются в положении Р, в то время как наиболее благоприятными являются аминокислотные остатки с полярными или небольшими алифатическими боковыми цепями i. Г1рн расщеплении синтетических субстратов X4 предпочтительность аминокислотных остатков убывает в ряду Хаа I. XiIx X , , , , , лучше всего расщеплялись субсграты, содержащие в Рположении остатки и , . Между тем. Б положении для пепсина предпочтительны остатки относительно гидрофобных аминокислот, таких, как , , V I , , . Даже остаток хорошо связывается этим подцентром фермента , , ,. Б Згподцентре пепсина находятся остатки , , , I , , 0 таблица 1. Однако и остатки с маленькими боковыми радикалами например. Наиболее благоприятными в этом положении являются остатки , , . Специфичность пепсина но отношению к Рзположснию изучена довольно мало. Из анализа кинетики гидролиза пененном серии хромофорных субстратов обшей формулы X, где X , , , , , . На основании анализа предпочтительности специфичности пепсина аминокислотных остатков в Рз положениях гидролизуемых им пептидных связей в белках был предложен гипотетический идеальный гептапептидный субстрат II V и ОН и смоделировано связывание его с активным центром фермента. Аналогично, исходя из таблицы соответствия специфичности пепсина аминокислот в Р4Ртположсниях. Данном и сотр. НРго . Следует заметить, что для улучшения растворимости субстрата в воде в широком диапазоне в положения Р. Тем не менее, по своим кинетическим характеристикам он является одним из лучших известных субстратов пепсина Км. Км составляют соответственно 0, мМ, ,1 с1 и 8 с1 мМ1 , . Позднее, на основе более детального анализа сайтов расщепления пепсином 7 различных белковых последовательностей, был синтезирован субстрат А , обладающий еще лучшими кинетическими характеристиками кКм 2, 1 М 1 с1 .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.192, запросов: 121