Создание монолитных аффинных сорбентов для выделения активаторов плазминогена

Создание монолитных аффинных сорбентов для выделения активаторов плазминогена

Автор: Влах, Евгения Георгиевна

Шифр специальности: 02.00.06

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2005

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 154 с. ил.

Артикул: 3298653

Автор: Влах, Евгения Георгиевна

Стоимость: 250 руб.

Создание монолитных аффинных сорбентов для выделения активаторов плазминогена  Создание монолитных аффинных сорбентов для выделения активаторов плазминогена 

СОДЕРЖАНИЕ
Слисок сокращений.
Введение.
1. Обзор литературы.
1.1. Бносспарация основной этап биотехнологии.
1.1.1. Использование аффинности в разделительных процессах
к. 1.1.2. Сущность аффинной хроматографии
1.1.3. Аффинные лиганды.
1.1.4. Количественное определение параметров аффинного комплсксообразования
1.2. Монолитные сорбенты для биоспепифических аффинных межфазовых разделений биологических молекул.
1.2.1. Требования, предъявляемые к стационарным фазам для аффинной хроматографии
1.2.2. Современные стационарные фазы монолитные сорбенты.
1.2.3. Высокоэффективная монолитная хроматография на основе ультракоротких ГМАЭДМА стационарных фаз
1.2.4. Применение высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии ВЭМДХ для аффинного выделения белков.
1.3. Способы создания аффинных матриц.
1.3.1. Нсковалентная иммобилизация
1.3.2. Ковалентная иммобилизация белков и пептидов
1.3.2.1. Основные аспекты.
1.3.2.2. Методы химической иммобилизации аминосодержащих
э лигандов
1.3.3. Прямой твердофазный синтез пептидов на монолитных носителях
1.3.3.1. Основная концепция твердофазного синтеза пептидов
1.3.3.2. Монолитные носители и твердофазный синтез на их основе
1.3.3.3. Проблема контроля пептидного синтеза на монолитных носителях.
1.3.4. Создание аффинных сорбентов полимеризацией предварительно модифицированных сомономеров.
1.4. Активаторы плазминогена
1.4.1. I viv взаимодействия белков крови при тромбозе и фибринолизе.
1.4.2. Стрептокиназа
1.4.3. Урокиназа и проурокиназа
1.4.4. Тканевый активатор илазминогена
1.4.5. Стафилокиназа
1.4.6. Производство и выделение активаторов плазминогена
2. Результаты и обсуждение
2.1. Создание аффинных сорбентов на основе макропористых монолитных ГМАЭЛМА дисков
2.1.1. Ковалентная иммобилизация белковых лигандов на поверхности монолитных ГМАЭДМА сорбентов
2.1.2. Ковалентная иммобилизация предварительно синтезированных пептидных лигандов.
2.1.2.1. Синтез и исследование пептидов.
2.1.2.2. Иммобилизация пептидных лигандов на поверхности монолитных носителей.
2.1.3. Прямой синтез пептидных лигандов на поверхности проточных ГМАЭДМА сорбентов дисков
2.1.3.1. Предварительная функционапизация монолитного носителя
2.1.3.2. Определение концентрации свободных аминогрупп на поверхности модифицированного полимерного сорбента.
2.1.3.3. Введение аланина в структуру сополимера.
2.1.3.4. Выбор стратегии твердофазного синтеза и анализа продуктов, полученных на монолитных носителях. Синтез модельных пептидов.
2.1.3.5. Синтез целевых последовательностей.
2.1.3.6. Характеристика матриц, полученных для аффинной хроматографии
2.2. Изучение аффинных свойств активаторов плазминогена методом ВЭ.МДХ
с использованием полученных белок и пептидсодержащих сорбентов
2.2.1. Хроматографическая оценка аффинных характеристик комплексов активаторов плазминогена с природными и синтетическими комплементами
2.2.1.2. Взаимодействие тканевого активатора плазминогена
с природными биокомплементами.
2.2.1.2. Взаимодействие тканевого активатора плазминогена с
иммобилизованными гомо и гетеропептидными лигандами.
2.2.1.3. Взаимодействие стрептокиназы и проурокиназы с иммобилизованными пептидными лигандами и
плазимногеном.
2.2.2. Сравнение характеристик аффинного комплексообразования
активаторов плазминогена с пептидными лигандами, иммобилизованными и впрямую синтезированными на поверхности ГМАЭДМА монолитов.
2.3. Скоростное а1и1Ннное выделение активаторов плазминогена из клеточных
супернатантов и модельных смесей белков
2.3.1. Исследование возможности неспецифического связывания различных белков полученными пептидсодержащими сорбентами.
2.3.2. Выделение тканевого активатора плазминогена из нативного клеточного супернатанта. Анализ чистоты выделенного продукта
2.3.3. Выделение стрептокиназы и проурокиназы из модельных белковых смесей
3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы.
3.2. Оборудование
3.3. Методы
3.3.1. Синтез вспомогательных веществ и производных аминокислот
3.3.2. Твердофазный синтез пептидов на полистирольном носителе.
3.3.2.1. Общая схема твердофазного пептидного синтеза
3.3.2.2. Качественные реакции, используемые в твердофазном пептидном синтезе.
3.3.2.3. Удаление пептидов с полимерного носителя
3.3.2.4. Деблокирование и окисление сульфгидрилъиых групп остатков
цистеина циклизация декапепида КСРСКУУССС.
3.3.2.5. Очистка и ОФ ВЭЖХ анализ синтезированных пептидов.
3.3.3. Твердофазный синтез пептидов на поверхности проточных монолитных ГМАЭДМА дисков.
3.3.3.1. Функционализация монолитного носителя.
3.3.3.2. ИКспектроскопия
3.3.3.3. Общая схема синтеза.
3.3.3.4. Циклизация пептида СООУУЯОРСКДА.
3.3.3.5. Выделение и предочистка пептидов для аналитических целей
3.3.3.6. ОФ ВЭЖХанализ пептидов, синтезированных на ГИАЭДМА дисках.
3.3.4. Методы исследования пептидных продуктов.
3.3.4.1. Аминокислотный анализ.
3.3.4.2. Массспектрометрия
3.3.4.3. Хроматографический анализ олиголизинов
3.3.5. Иммобилизация аффинных лигандов на поверхности монолитных макропористых ГМАЭДМА сорбентов.
3.3.5.1. Характеристика и подготовка стационарных фаз
3.3.5.2. Иммобилизация пептидных лигандов
3.3.5.3. Иммобилизация белков
3.3.5.4. Аналитические методы определения концентрации белок и пептидсодержащих растворов.
3.3.6. Определение параметров аффинного взаимодействия.
3.3.6.1. Аффинная ВЭМДХ
3.3.6.2. Определение количественных параметров аффинного комплексообразования.
3.3.7. Выделение активаторов плазминогена из клеточных супернатантов и модельных смесей белков
3.3.7.1. Приготовление клеточных супернатантов.
3.3.7.2. Выделение тканевого активатора плазминогена из
клеточных супернатантов.
3.3.7.3. Выделение стрептокиназы и проурокиназы из модельных смесей белков
3.3.7.4. Иммуноферментный аначиз метод конкурентного связывания.
3.3.7.5. Гельэлектрофорез.
Выводы.
Список литературы


Работа выполнена в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера Германия гранты и ННОРАН 6 0 при участии лаборатории 4 ИВС РАН и Института прикладной микробиологии Университета сельскохозяйственных наук Вены Австрия, а также при финансовой поддержке фирмы I i . Любляна, Словения. Современный уровень генной инженерии позволяет достаточно легко масштабировать производство природных биологически активных веществ различных классов, в частности, белков. При этом возникает необходимость создания эффективных методов, как аналитического производственного контроля, так и препаративного выделения чистого продукта непосредственно из клеточных лизатов и супернатантов. Таким образом, разработка стадии выделения и тонкой очистки, т. Для очистки целевой субстанции в условиях непрерывного биотехнологического процесса широко используются такие методы как осаждение, ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, жидкостная хроматография и др. По современному определению, хроматографический сепарационный процесс происходит в условиях динамического квазиравновссного распределения вещества между подвижной жидкой и неподвижной твердой фазой 2. При этом разделяемые биологические молекулы взаимодействуют с поверхностью неподвижной, как правило, пористой фазы по механизму адсорбции положительное взаимодействие или эксклюзии отрицательное взаимодействие или исключение из нор малого размера. Однако биомолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физикохимическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помощью ионообменной хроматографии, гельфильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует значительных временных затрат. Вследствие этого, в процессе выделения существенно падает биологическая активность продукта изза его денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. Известно, что биологические взаимодействия, происходящие i viv, имеют в своей основе образование специфических комплексов по принципу биологической комплементарности молекул, иными словами, одним из наиболее характерных свойств этих биологических объектов является их способность обратимо связывать другие вещества. ДНК, и т. Использование биоспецифических взаимодействий с успехом применяется в биотехнологических процессах для анализа и выделения продуктов высочайшей степени очистки 4. Наиболее подходящими для этих целей по праву считаются методы, основанные на аффинности выделяемого компонента к подобранной к нему парс лиганду . Для очистки веществ, предназначенных для нужд молекулярной биологии, диагностики и терапии, безусловное предпочтение отдается аффинной хроматографии 3,8,9. Использование аффинных взаимодействий в хроматографическом процессе позволяет значительно повысить селективность очистки, сохранив при этом основные достоинства метода. Аффинная хроматография вид жидкостной хроматографии, основанный на образовании специфических обратимо диссоциирующих комплексов биологических макромолекул с комплементарными адсорбционными центрами лигандами, или аффинантами, иммобилизованными на поверхности неподвижной фазы 3. Для успешного проведения аффинной хроматографии необходимо, чтобы образование комплекса целевой биомолекулы с лигандом, ковалентно связанным с неподвижной фазой, было адекватно образованию аналогичного комплекса в растворе. Очевидно, что это требование может реализоваться только в условиях максимально незатрудненного твердофазного образования специфического комплекса целевое вещество Р лиганд . Р концентрация не левого вещества в растворе концентрация комплекса константа диссоциации аффинного комплекса. Как правило, К заметно отличается от таковой, определяемой в растворе. Увеличение значения данного параметра свидетельствует об изменении пространственной структуры лиганда в результате его связывания с поверхностью сорбента. Напротив, уменьшение обсуждаемой характеристики может объясняться неспецифической адсорбцией растворенного комплемента, как на носителе, так и на молекулярной поверхности образующегося комплекса 3.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.289, запросов: 121