Совершенствование лабораторной диагностики алеутской болезни норок

• Автор: Михеев, Юрий Васильевич
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Принятые сокращения
Глава I . ВВЕДЕНИЕ
Глава II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.Алеутская болезнь норок
а) возбудитель АБН
б)структура генома вируса АБН
в)неструктурные белки вируса АБН
г)структурные белки вируса АБН
д)характеристика штаммов вируса АБН
2.Пути распространения вируса АБН
3.Клинические формы и патологоанатомические изменения при АБН
3.1.Алеутская болезнь новорожденных щенков
3.2.Классическая форма АБН
4.Иммунитет при АБН
5 . Профилактика АБН
6 . Диагностика АБН
Глава III.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.МАТЕРИАЛ Ы
1.1.Вирусы, бактериальные штаммы, плазмиды и питательные среды
1.2.Реактивы
1.3.Праймеры
2. МЕТОДЫ
2.1.Выделение плазмидной ДНК щелочным методом
2.2.Обработка ДНК рестрикционным эндонуклеазами
2 . 3 . Постановка полимеразой цепной реакции
2.4.Электрофорез в агарозном геле
2.5.Очистка ПЦР-фрагментов электрофорезом в агарозном геле
2.6.Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
2.7.Получение рекомбинантных молекул in vitro
2.8.Приготовление компетентных клеток и трансформация их препаратами плазмидной ДНК
2.8.1.Подготовка компетентных клеток
2.8.2.Электротрансформация
2.9.Выделение суммарной клеточной ДНК из органов животных(фенольный метод)
2.10.Клонирование ПЦР-продуктов
2.11.Кинирование ПЦР-продуктов
2.12.Достройка ПЦР-продуктов
2.13.Электофорез белков в ПААГ-ДСН
2.14.Окраска кумасси
2.15.Методика постановки ПЦР-ИФА
2.15.1.Полимеразная цепная реакция
2.15.2.Подготовка полестероловых микроплашек для ПЦР-ИФА
2.15.3.Условия постановки ПЦР-ИФА
2 .16 . Постановка РИЭОФ на АБН
2 .17.Определение активности термостабильной пирофосфатазы
(PPase)
2 .18.Экспрессия белков
2.19.Определение растворимости белка
2.20.Методика иммуноферментного анализа
2.20.1.Сущность метода
2.20.2.Постановка реакции
2 . 20.2.1.Сенсибилизация планшетов
2.20.2.2.Внесение исследуемых сывороток и антивидвого коньюгата
2 . 20.2.3 .Внесение субстрата и учет реакции
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ЧАСТЫ. Разработка ПЦР - диагностикума для обнаружения ДНК
вируса алеутской болезни норок
1.Получение ПЦР-продукта

2.Получение плазмиды У1С (положительный контроль)
3.Получение плазмиды У1СВК (внутренний контроль)
4.Отработка условий постановки полимеразной цепной реакции
с плазмид У1С и У1СВК
5.Определение минимального расчетного количества плазмиды У1С, необходимого для детекции ПЦР-продукта в агарозном

6.Потеря ДНК вируса алеутской болезни норок при выделении
фенольным методом
7.Определение минимального количества плазмиды У1СВК для
проведения диагностического ПЦР
8.Апробация ПЦР с пробами клинического материала
ЧАСТЫ I. Детекция ПЦР-продуктов ДНК вируса алеутской
болезни норок в ИФА формате
1.Определение специфичности праймеров Ы-А1еиб1 и 14-А1еиб
2. Определение способности ПЦР-продуктов вируса АБН с праймеров Ц-А1еиб1 и Ы-А1еиб2 связываться с белком ЬУ-ССЫ
3.Определение рабочей концентрации белка ЬУ-ССЫ4 для детекции ПЦР-продуктов в плашечном ИФА - формате
4.Сравнение чувствительности ПЦР и ПЦР-ИФА при детекции ПЦР-продуктов вируса алеутской болезни норок
5.Апробация с пробами клинического материала
ЧАСТЫ11.Типирование вируса АБН выделенного в зверосовхозе «Родники» Московской области
1.Эпизоотологическое состояние зверосовхоза «Родники»
Московской области по алеутской болезни норок
2-Сиквенс ПЦР-продуктов изолятов вируса алеутской болезни норок и сравнивание их со штаммом АБУ-й
3.Анализ гипервариабельного участка вирусов АБН

Рис 4. Диаграмма развития алеутской болезни норок. • Иммунокомплексы и болезнь почек

Плазмоцитоз илимфоденапатия ІШШІ I

10* _|
10* _

На диаграмме показано развитие алеутской болезни норок.
На 5-6 день после экспериментального заражения норки с генотипом аа (например - сапфир) в крови в высоком титре появляется вирус алеутской болезни. Его пик приходиться на 8-10 день после заражения. В дальнейшем под действием нарастающего количества антител (первые антитела появляются на 5-10 день после заражения, достигая максимума на 30 день) вирус захватывается антителами, и оседает в виде иммунных комплексов в почках и сосудах приводя к гибели животное. В это время развивается плазмоцитоз и лимфаденопатия.