Изучение вертикального переноса генов от биозащищенных растений к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам

• Автор: Крутенко, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 06.01.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Краснодар
• Количество страниц: 128 с. : ил.

Обзор литературы
Трансгенные культуры: распространение и использование в сельскохозяйственном производстве Вертикальный перенос генов
Факторы, определяющие степень риска переноса генов
Перенос генов к другим возделываемым сортам растений
Биобезопасность трансгенного картофеля
Биобезопасность трансгенной кукурузы
Биобезопасность трансгенной сои
Методические подходы к определению наличия трансгенов в пищевых продуктах и кормах Методы оценки содержания генетически-модифицированных источников
Методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР)
ПЦР-идентификация трансгенов Неспецифическая ПЦР-детекция модифицированных источников
Другие методы детекции модифицированных источников Апробация методов ГМ-детекции Материалы и методы исследований
Объект исследования
Использованные материалы и оборудование
Химические реактивы

2.2.2 Оборудование
2.3 Использованные методы
2.3.1 Выделение ДНК из различных тканей растения
2.3.2 Амплификация геномной ДНК
2.3.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.3.4 Фотодокументирование продуктов амплификации
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 ПЦР-детекция трансгенных растений
3.2 ПЦР-идентификация трансгенных растений
3.3 Влияние различных веществ на специфичность и (или) выход ПЦР-реакции
3.4 Полуколичественная оценка генетически-модифицированных источников (ГМИ)
3.5 Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-картофеля
3.6 Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы
Выводы
Практические рекомендации Список литературы Приложения

Актуальность работы. Успехи современной биотехнологии привели к созданию генно-модифицированных (ГМ) растений и их широкому внедрению в практику сельскохозяйственного производства.
Перспективным направлением в биологической защите растений является использование генно-модифицированных биозащищенных от вредителей сортов, а также сортов, устойчивых к гербицидам. Это особенно важно, если учесть, что многие вредители сельскохозяйственных культур приобрели резистентность к большинству химических инсектицидов, следствием чего является увеличение объемов их внесения, загрязнение окружающей среды и в итоге потери урожая.
Значительный вред урожаю также наносит конкуренция со стороны сорных растений. В данной ситуации имеет большое значение использование раундап-защищенных сортов сои и кукурузы, так как Раундап широко применяемый гербицид, известный своей очень высокой эффективностью и имеющий высокие показатели безопасности. Широкое использование ГМ-растений в сельскохозяйственном производстве ставит на повестку дня вопросы их биобезопасности.
Одним из аспектов биобезопасности ГМ-культур является оценка вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и диким сородичам. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению.
В этой связи актуальность наших исследований определяется необходимостью инструментального контроля ГМ-растений и получаемых на их основе продуктов и кормов для животноводства. Основным методом для быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений в настоящее время является ПЦР (полимеразная цепная реакция). Однако используемые в нашей стране методики ПЦР-детекции не достаточно эффективны и требуют
2.3.2 АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК
Амплификацию ДНК проводили в 25 мкл реакционной смеси. Все компоненты кроме ДНК входят в набор для амплификации фирмы «Диалат Ltd» (Москва).
Приготавливали реакционную смесь, путем последовательного добавления в одну из пробирок компонентов (таблица 2.1), а затем аликвоты реакционной смеси (Master mix) разливали по соответствующим пробиркам. Пробирки подписывали и вносили в них геномную ДНК, затем перемешивали пипеткой. Для удаления пузырьков пробирки центрифугировали несколько секунд, после этого поверх реакционной смеси наслаивали 17 мкл минерального масла.
Таблица 1 - Приготовление реакционной смеси для проведения ПЦР
Компонент реакционной смеси На 1 пробу, мкл
Н20 18,625
Реакционный буфер без MgCl2 (ЮХ) 2,5
М§С12 0,75
Смесь бЫТР’э 0,5
Праймеры* По 0,25
Taq-пoлимepaзa 0,125
ДНК
*В работе были использованы следующие праймеры: SA и SS (358-промотор); NA и NS (NOS-терминатор); L1 и L2 (лектин); RPss и FPss (пататин); RR01 и RR04 (СР4 EPSPS); СгуІІІА 01-5’ и СгуІІІА 01-3’ (Cry III А)-синтезированы фирмой «Диалат Ltd». PZ 19 L и PZ 19 R (зеин-19кДа) -любезно предоставлены нам Д. Сметаниным (КНИИСХ, Краснодар).
Далее пробирки помещали в амплификатор «Терцик» («ДНК-Технология») и запускали одну следующих программ: