Мезенхимные стромальные клетки из эмбриональных и дефинитивных источников : фенотипические и функциональные особенности

• Автор: Паюшина, Ольга Викторовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 328 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. История открытия, номенклатура и критерии МСК
1.1. История исследования МСК
1.2. Терминология
1.3. Методы выделения МСК
1.4. Минимальные критерии для идентификации МСК
2. Основные фенотипические и функциональные
характеристики МСК
2.1. Поверхностный фенотип и профиль экспрессии генов
2.2. Секреторный профиль
2.3. Адгезивные свойства
2.4. Рост in vitro
2.4.1. Характеристика роста при культивировании в стандартных условиях
2.4.2. Старение н самоподдержанне
2.4.3. Влияние факторов роста и условий культивирования на МСК in vitro.
2.5. Потенции к днфференцнровке
2.5.1. Остеогенез
2.5.2. Адипогенез
2.5.3. Хондрогенез
2.5.4. Дифференцировка в другие мезенхимные и мезодермальные производные
2.5.5. Дифференцировка в экто- и эитодермальные производные
2.5.6. Возможные механизмы пластичности
3. Структура популяции стромальных клеток
3.1. Гетерогенность популяции МСК
3.2. Возможная организация стромального днфферона
3.2.1. Коммитированные стропильные предшественники
3.2.2. Предполагаемые мезенхимные стволовые клетки
3.2.3. Общие предшественники стромальных н кроветворных клеток
3.2.4. Плюрипотентные клетки
4. Локализация и функции МСК в организме
4.1. Локализация МСК
4.1.1. Источники МСК в развивающемся и зрелом организме
4.1.2. Микроокружение МСК
4.1.3. Миграция МСК
4.2. Роль МСК в регенерации
4.2.1. Дифференцировка МСК in vivo
4.2.2. Трофическая активность

4.3. МСК кроветворных органов как клетки,
организующие кроветворное микроокружение
4.3.1. Стромальная регуляция гемопоэза
4.3.1.1. Клеточный состав кроветворной стромы
4.3.1.2. Механизмы стромальной регуляции кроветворения
4.3.1.3. Роль МСК в поддержании кроветворения
4.3.2. Характеристика МСК из дефинитивных и транзиторных органов гемопоэза
4.3.2.1. Костный мозг
4.3.2.2. Печень
4.3.2.3. Селезенка
5. Проблемы использования МСК в регенеративной медицине
5.1. Подходы к клиническому использованию МСК
5.1.1. Системное введение
5.1.2. Локальная доставка в место повреждения
5.1.3. Тканевая инженерия
5.1.4. Генная терапия
5.2. Область применения МСК
5.2.1. Заболевания опорно-двигательного аппарата
5.2.2. Сердечно-сосудистые заболевания
5.2.3. Неврология
5.2.4. Гематология н онкология
5.2.5. Пммуноконфлпктные состояния и аутоиммунные заболевания
5.2.6. Другие заболевания
5.3. Проблемы и возможные риски применения МСК в клинике
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Экспериментальные животные
2. Культивирование клеток
2.1. Выделение клеток из тканей
2.2. Первичные и пассируемые культуры стромальных клеток
2.3. Анализ адгезивных свойств стромальных н миогенных предшественников
2.4. Обработка клеток 5-фторурацнлом
2.5. Индукция дифференцнровки МСК in vitro
2.6. Совместное культивирование различных клеточных популяций
2.7. Культивирование МСК на носителях
3. Эксперименты in vivo
3.1. Эктопическая трансплантация печени зародышей
3.2. Трансплантация клеток в диффузионных камерах
3.3. Трансплантация клеток на носителях

4. Анализ результатов
4.1. Морфологические исследования
4.2. Цитохимические исследования
4.3. Иммуноцнтохнмнчсскнс исследования
4.4. Выявление никотиновых холннорсцепторов с помощью а-бунгаротоксина
4.5. Молекулярно-генетический анализ
4.6. Количественный анализ и статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Характеристика клонального роста МСК в первичной культуре
1.1. Содержание клоногенных МСК в популяциях клеток кроветворных
органов крысы и мыши в пре- и иостнатальном онтогенезе
1.2. Морфология н клеточный состав колоний, образуемых КОЕ-Ф
1.3. Сравнительная оценка остеогенных потенций КОЕ-Ф из кроветворных органов в ходе онтогенеза на основании активности
щелочной фосфатазы в клетках колоний
1.4. Антигенный фенотип клеток колоний: экспрессия маркеров МСК
2. Гетерогенность клеточного состава стромы зародышевой печени
2.1. Миофнбробласты
2.1.1. Морфология мнофибробластоподобных клеток и экспрессия ими деемнна
2.1.2. Экспрессия специфических маркеров мпофнбробластов
различного происхождения
2.2. Колонии черспнцеобразных клеток
2.2.1. Численность и морфология колонии, содержащих черепнцеобразные клетки
2.2.2. Экспрессия маркеров эпителиальных и эндотелиальных клеток
2.3. Скелетно-мышечные элементы
2.3.1. Морфология н фенотип спонтанно образующихся мнотуб
2.3.2. Функциональные характеристики миотуб
2.3.3. Адгезивные свойства предшественников миотуб
2.3.3.1. Адгезия миогениых предшественников к белкам внеклеточного матрикса.
2.3.3.2. Содержание миогсиных предшественников
в субпопуляциях клеток, различающихся по срокам прикрепления к пластику
3. Характеристика МСК в монослое при последовательном пассировании (субкультивнрованнн)
3.1. Оценка пролиферативной активности пассируемых клеток
стромы кроветворных органов на основании экспрессии антигена Ю-
3.2. Морфология и фенотип пассируемых стромальных клеток
3.2.1. Морфологические изменения клеток в ходе пассирования
3.2.2. Оценка содержания остеогенных клеток в пассируемых культурах
на основании активности щелочной фосфатазы

(динамического сжатия геля), приводящего к усилению экспрессии клетками эндогенного TGF-Р [Huang et al., 2004] и активации сигнального пути ERK1/2 [Pelaez et al., 2012].
В ходе хондрогенной дифференцировки МСК в микромассовых культурах клетки округляются, приобретают морфологию хондроцитов и окружаются метахроматически окрашивающимся внеклеточным матриксом, содержащим коллаген II типа, аггрекан и другие протеогликаны, характерные для хряща [Johnstone et al., 1998; Worster et al., 2001; Sekiya et al., 2002 b; Indrawattana et al., 2004]. На поверхности агрегата формируется слой уплощенных клеток, подобный надхрящнице; расположенные под ним клетки первыми начинают синтезировать коллаген II типа. Постепенно дифференцировка распространяется по всему агрегату, в последнюю очередь затрагивая его центральную часть. В первую неделю индукции размер агрегатов изменяется мало, но в дальнейшем они увеличиваются в 2-3 раза [Pittenger, Marshak, 2001]. На поздних стадиях хондрогенеза отмечаются признаки гипертрофии хряща -отложение коллагенов I и X типа, появление активности ЩФ [Johnstone et al., 1998; Yoo et al., 1998; Hanada et al., 2001; Lin et al., 2005; Weiss et al., 2010]. Дифференцировке МСК до стадии гипертрофированных хондроцитов способствует удаление из среды TGF-(3, снижение концентрации дексаметазона и добавление тироксина [Mackay et al., 1998]; добавление bFGF на поздних стадиях дифференцировки, напротив, препятствует гипертрофии [Weiss et al., 2010].
Изучение молекулярных механизмов регуляции хондрогенеза показало, что важнейшую роль в ней играет фактор транскрипции Sox9, активация которого приводит, в частности, к включению генов коллагена II типа и аггрекана [de Crombrugghe et al., 2000]. Индукция экспрессии Sox9 показана при культивировании МСК в хондрогенной среде с TGF-p [Lin et al., 2005]. Влияние TGF-P на хрящевую дифференцнровку опосредуется двумя сигнальными путями - через сигнальные молекулы семейства SMAD [Massague, Wotton, 2000] и через митоген-активируемую протеокиназу МАРК [Tuli et al., 2002]. Кроме того, при стимуляции хондрогенеза TGF-P проявляет синергизм с Wnt, то есть активация сигнального пути через Wnt может быть одним из механизмов влияния TGF-P на хондрогенез [Zhou et al., 2004].
2.5.4. Дифференцировка в другие мезенхимные и мсзодсрмальные производные
Наряду с хорошо изученными потенциями МСК к остео-, адипо- и хондрогенезу, показана их способность дифференцироваться в ряд других тканей, происходящих в эмбриогенезе из мезенхимы, а также из мезодермы (являющейся, как известно, главным источником мезенхимных элементов). Так, под влиянием BMP-12 и BMP-13 МСК приобретают морфологические и фенотипические черты фиброцитов сухожилий и связок - вытягиваются, формируют переплетающиеся отростки, усиливают экспрессию теиомодулина, коллагена I типа