Молекулярные механизмы ответов эндометриальных стволовых клеток человека на окислительный стресс

• Автор: Бородкина, Александра Васильевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 143 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
Цель и задачи исследования
Основные положения, выносимые на защиту
Научная новизна
Теоретическая и практическая значимость
Публикации
Апробация работы
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Основные понятия биологии стволовых клеток
1.1.1 Основные этапы в истории открытия и изучения стволовых клеток
1.1.2 Определение, свойства и классификация стволовых клеток
1.1.3 Идентификация стволовых клеток
1.1.4 Мезенхимные стволовые клетки из десквамированного эндометрия
1.2 Стволовые клетки и стресс
1.2.1 Окислительный стресс и стволовые клетки человека
1.2.2 Различные реакции эмбриональных и мезенхимных стволовых клеток человека на стресс
1.3 Апоптоз
1.3.1 Основные маркеры апоптоза
1.3.2 Внутриклеточная машинерия апоптоза
1.4 Феномен старения клеток
1.4.1 Репликативная и стресс-индуцированная формы клеточного старения
1.4.2 Укорочение теломер, как одна из причин развития старения
1.5 Механизмы, лежащие в основе клеточного старения
1.5.1 Инициация клеточного старения в ответ на повреждение ДНК
1.5.2 Активация DDR приводит к индукции блока клеточного цикла
1.5.3 Для установления и развития старения необходима постоянная активация DDR
1.5.4 Роль АФК в развитии клеточного старения
1.5.5 Митохондрии - основной источник эндогенных АФК
1.5.6 Вклад митохондрий в развитие клеточного старения

1.5.7 Участие ферментов антиоксидантной защиты в клеточном старении
1.5.8 р38 МАРК играет важную роль как в репликативном, так и в стресс-индуцированном старении клеток
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Клеточные линии и особенности их культивирования
2.2 Моделирование окислительного стресса и условия обработки клеток
2.3 Оценка жизнеспособности методом МТТ
2.4 Метод проточной цитофлуориметрии
2.4.1. Анализ апоптотнческих клеток, окрашенных с помощью йодида пропидия и конъюгата Аппехт У/НТС
2.4.2. Анализ распределения по фазам клеточного цикла, выживаемости и размера клеток с помощью метода проточной цитометрии
2.4.3. Измерение уровня внутриклеточных АФК и митохондриальных пероксидов, совокупной митохондриальной массы и мембранного потенциала митохондрий (ММП)..
2.5 Использование конфокальной микроскопии для оценки внутриклеточных АФК, клеточных пероксидов, ММП и митохондриальной массы
2.6 Электрофорез и иммуноблотинг
2.6.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения
2.6.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.6.3. Иммуноблотинг со специфическими антителами
2.7 Анализ экспрессии генов
2.8 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток
2.9 Выявление активности 8А-(1-Оа
2.10 Использованные реактивы, ингибиторы н антиоксиданты
2.11 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Оценка устойчивости различных типов клеток к окислительному стрессу
3.2. Исследование характера гибели ЭСК, фибробластов и эМСК при окислительном стрессе
3.2.1. НгОг-индуцированный апоптоз ЭСК
3.2.2. Гибель фибробластов при окислительном стрессе
3.2.3. Характер ответа эМСК на разные дозы Н2О
3.3. Исследование ответа фибробластов на действие Н2О2 в сублеталыюй концентрации
3.3.1. Индукция преждевременного старения фибробластов после обработки 200 мкМ П2О
3.4. Преждевременное старение эМСК в ответ на действие Н202 в сублеталыюй концентрации
3.4.1. Развитие фенотипа преждевременного старения в НгОг-обработанных эМСК

3.4.2. Остановка пролиферации и арест клеточного цикла в Н202-обработанных эМСК
3.4.3. Реализация блока клеточного цикла в Н202-обработанных эМСК
3.5. Исследование механизма, лежащего в основе стресс-индуцированного старения эМСК.
3.5.1. Быстрое накопление экзогенной Н202 в эМСК
3.5.2. Ранняя активация ответа на повреждение ДНК вследствие проникновения Н202 в эМСК
3.5.3. Активация MAP-киназных путей в эМСК в условиях окислительного стресса
3.5.4. Развитие Н202-индуцированного старения эМСК опосредовано повышением уровня эндогенных АФК вследствие роста митохондриальной активности
3.5.5. Повышение уровня эндогенных АФК приводит к продолжительной активации DDR в процессе развития Н202-индуцированного старения эМСК
3.6. Пути предотвращения преждевременного старения эМСК в условиях окислительного стресса
3.6.1. Использование различных антиоксидантов для предотвращения индуцированного преждевременного старения эМСК
3.6.2. Ингибирование MAP-киназы р38 частично предотвращает развитие Н202-индуцированного старения эМСК
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

продукция АФК связана не с длительным культивированием in vitro, а скорее всего, является следствием индукции ареста клеточного цикла при старении клеток (Lawless et al., 2012). Более того, она необходима для поддержания DDR в постоянно активном состоянии и для последующей стабилизации ареста клеточного цикла в процессе развития старения (Passos et al., 2010).
Еще одним важным свидетельством в пользу существования взаимосвязи между АФК и старением явилось то, что обработка клеток сублетальной дозой перекиси водорода (Н2О2) приводила к развитию преждевременного старения клеток (Chen et al., 1998; Frippiat ct al., 2000; Colavitti, Finkei, 2005; Burova et al., 2013; Yagi et al., 2013).
Другие доказательства участия АФК в процессе старения были получены в экспериментах, направленных на снижение уровня внутриклеточных свободных радикалов. Так, например, в клетках, культивировавшихся в условиях низкого содержания кислорода, старение развивалось медленнее, чем в контрольных (Packer, Fuehr, 1977; Forsyth et al., 2003; Richter, von Zglinicki, 2007). Использование различных антиоксидантов, таких как М-ацетил-Ь-цистеин (N-acetyl-L-cysteine, NAC), пирролидин дитиокарбамат (Pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC), фешш-2-нафтиламин (phenyl-alpha-tert-butyl nitrone, PBN) (Lee et al., 1999; von Zglinicki et al., 2000; Jung et al., 2004), а также полифенолов, обладающих антиоксидантной активностью (Katiyar et al., 2001; Као et al., 2010; Yagi et al., 2013) также приводило к частичному предотвращению развития клеточного старения. Помимо этого, оверэкспрессия ферментов антиоксидантной защиты (Serra et al., 2003) также способствовала увеличению продолжительности жизни клеток в культуре. В ряде работ описано применение препаратов, обладающих антиокисдантными свойствами, в качестве геропротекторов, то есть веществ, способных увеличивать продолжительность жизни живых организмов (Анисимов, 2000). Например, 2-меркаптоэтнламин (Harman, 1994), бутилированный гидрокентолуол (2,6-диберт-бутил-4-метилфенол) (Clapp et al., 1979) и фенилбутилнитрон (Saito et al., 1998) способствовали увеличению средней продолжительности жизни мышей, что служит еще одним свидетельством в пользу вовлеченности АФК в процесс старения.
Важно отметить, что недавние исследования выявили корреляцию между активацией основных белков, участвующих в развитии старения, и продукцией АФК. Установлено, что активация транскрипционного фактора р53 может приводить к усилению генерации внутриклеточных АФК (Macip et al., 2003; Liu et al., 2008; Vigneron, Vousden, 2010). С другой стороны, оверэкспрессия р53 трансактивирует ряд р53-нндуцируемых генов, которые кодируют АФК-генерирующие ферменты (quinine oxidoreductase, proline oxidase) (Polyak et al., 1997). В свою очередь, АФК могут опосредованно влиять на фосфорилирование р53, например, через р38 МАРК (mitogen activated protein kinase) (Bragado et al., 2007), ATM (Kurz, Lees-Miller, 2004)