Внецентросомные детерминанты организации микротрубочек в интерфазных клетках

• Автор: Бродский, Илья Борисович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 76 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Строение микротрубочек
Система микротрубочек с центром в центросоме
Нуклеация миктротрубочек на центросоме
Заякоривание микротрубочек на центросоме
Системы микротрубочек, построенные без участия центросомы
Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам
Структура динеин-динактинового комплекса
Взаимодействие микротрубочкого цитоскелета с мембранными органеллами
Взаимодействие микротрубочек с клеточным кортексом
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
молекулярное клонирование
RT-PCR и сайт-направленный мутагенез
Антитела
Культивирование клеток
Получение цитопластов
Микроскопия
Анализ изображений
РЕЗУЛЬТАТЫ
Система микротрубочек в стареющих цитопластах постепенно утрачивает радиальный характер

Хаотизация микротрубочек цитопласта не связана с утратой активности центросомы
В стареющих цитопластах не происходит стабилизации микротрубочек
Растущие в стареющих цитопластах микротрубочки не прекращают свой рост возле края
цитопласта
Растущие микротрубочки в стареющих цитопластах не взаимодействуют клеточным кортексом.

Находится ли центросома (МТОЦ) цитопластов в их геометрическом центре?
Разрушение динеин-динактинового комплекса ведет к хаотизации системы микротрубочек в
КЛЕТКАХ BSC-1 ИНеЬА
В бесцентросомных цитопластах микротрубочки нуклеируются преимущественно в центральной
области
Аппарат Гольджи и СОРІ зависимый транспорт не участвуют в формировании радиальной
системы микротрубочек
Окадаевая кислота эффективно блокирует формирование радиальной системы микротрубочек у
бесцентросомных цитопластов
Ингибирование образования СОРИ окаймления эффективно блокирует образование
бесцентросомной радиальной системы микротрубочек
кластеризация ERES при сверхэкспрессии конститутивно-активного мутанта Sari a[H79G]
происходит только при наличии микротрубочпк
Кластеризация ERES при сверхэксперссии конститутивно активного мутанта зависит от активности диппин-динактинового комплекса
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
BFA - брефельдин А
СС (Coiled-Coil) - скрученная а-спираль в белках
GFP (Green Fluorescent Protein) - зеленый флуоресцентный белок
СТ - (С-terminus) С-концевой участок
Су5 - цианиновый краситель
DHC (Dynein Heavy Chain) - тяжелая цепь динеина
DIC (Dynein Intermediate Chain) - промежуточная цепь динеина
ERES - (ER exit sites) - сайты экспорта белков из эндоплазматического ретикулума ERGIC - (ER Golgi intermediate compartment) - промежеточный компартмент между эндоплазматическим ретикумом и аппаратом Гольджи FITC - флуоресцеинизотиоцианат
head - N-концевой участок
MAP (Microtubule Associated Protein) - белки, ассоциированные с микротрубочками
MD - междоменный участок
МТОЦ - микротрубочко-организующий центр
mCherry - красный флуоресцентный белок
ОА - окадаевая кислота
RT-PCR (Reverse Transcription Poiimerase Chain Reaction) - обратнотранскриптазная
полимеразная цепная реакция
SD (standart deviation) - стандартное отклонение
TRITC - тетраметилродаминизотиоцианат
у -TuRC (gamma-Tubulin Ring Complex) -кольцевой комплекс гамма-тубулина ЭР - эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ
Цитоскелет животных клеток, представленный микротрубочками, актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами, обеспечивает внутриклеточный транспорт молекул и органелл, а также перемещение самих клеток.
Интерфазные микротрубочки в большинстве типов культивируемых клеток и в некоторых дифференцированных клетках in situ организованы в радиальную систему: к периферии клетки они отходят от центра организации, которым в большинстве случаев служит центросома. На центросоме начинается рост микротрубочек и заякориваюгея их «минус»-концы. Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков - специализированных механохимических АТФаз, относящихся к двум семействам: динеинам и кинезинам. Динеины перемещаются по направлению к «минус»-концу микротрубочек, а кинезины - к «плюс»-концу. Таким образом, радиальная организация микротрубочек обеспечивает направленность внутриклеточного транспорта. Однако радиальная система микротрубочек может образовываться и без участия центросомы. Такая система обнаружена, например, в бесцентриолярных фрагментах меланофоров рыб (Rodionov and Borisy, 1997; Cytrynbaum et al., 2004; Malikov et al., 2005), и организаторами этой системы служат меланосомы. В монослое клеток эпидермиса микротрубочки образуют радиально-подобную систему без выраженного центра, где микротрубочки отходят от околоядерной области в направлении к периферии (Lechter and Fuchs, 2007). Другие, помимо центросомы, центры организации системы микротрубочек изучены недостаточно. Центросома обычно является очень мощным, доминирующим центром организации микротрубочек и в ее присутствии остальные центры организации микротрубочек могут быть незаметны. Предполагают, что в организации системы микротрубочек в клетках млекопитающих участвуют динеин-динактиновые комплексы, связанные транспортными везикулами или органеллами аппарата секреторного транспорта. Сами везикулы могут организовывать микротрубочки, нуклеируя их, ассоциируясь с ними и передвигаясь по ним, подобно пигментным гранулам во фрагменте меланофора (Malikov et al., 2005). Роль мембран в организации системы микротрубочек практически не исследована, хотя в последнее время появились работы, свидетельствующие о том, что мембраны аппарат Гольджи содержат белковые комплексы, нуклеирующие микротрубочки (Efimov et al., 2007).
Очевидно также, что для поддержания радиальной структуры сети микротрубочек, помимо центра организации, важным условием (детерминантой) является остановка роста микротрубочек у клеточной границы. Иначе бы отдельная микротрубочка могла,

РЕЗУЛЬТАТЫ
Система микротрубочек в стареющих цитопластах постепенно утрачивает
радиальный характер
В данной части работы для получения цитопластов использовали клетки линии Уего (фибробласты почки зелёной мартышки). Около 99% полученных с помощью центрифугирования в цитохалазине В цитопластов содержали центросому, визуализирующуюся с помощью иммунофлуресцентного окрашивания на гамма-тубулин. Через 2 ч после получения большинство цитопластов содержали радиальную систему микротрубочек, как и исходные контрольные клетки (РисЮ А, Б). С увеличением времени инкубации после энуклеации увеличивался процент цитопластов с хаотическим расположением микротрубочек, хотя окрашивание центросомы антителами к гамма-тубулину сохранялось. При этом система микротрубочек в клетках после процедуры энуклеации, не изменялась (Рис. 10 О). Через 17 ч после энуклеации в большинстве цитопластов структура сети микротрубочек становилась хаотичной, запутанной (Рис. 10 В, Г). В околоцентросомной области цитопластов, однако, можно было проследить некоторую радиальность микротрубочек с центром в центросоме. Для точной оценки радиальности системы микротрубочек мы построили диаграммы распределения флуоресценции по длине радиуса клеток Уего, свежеполученных (здесь и далее — 1-2 ч после центрифугирования) цитопластов или стареющих (здесь и далее — 17 ч после центрифугирования). В клетках Уего или в свежеполученных цитопластах количество тубулина убывает от центра клетки к периферии практически линейно (Рис. 10 Е, Ж), что соответствует радиальному расположению микротрубочек (Смурова и др., 2003). В стареющих же цитопластах этот график выходит на плато (Рис. 10 3), что соответствует случайному, хаотическому распределению микротрубочек в цитоплазме (Смурова и др., 2003).
Причинами нарушения радиальности системы микротрубочек в цитопластах могут быть потеря центросомой способности нуклеировать и/или заякоривать новые микротрубочки или нарушение динамики сборки/разборки самих микротрубочек, поскольку стабилизация микротрубочек ведет к потере их связи с центросомой.
Хаотизация микротрубочек цитопласта не связана с утратой активности
центросомы.
Для выяснения причин утраты радиальности микротрубочек в цитопластах мы исследовали активность в них центросомы. Цитопласты охлаждали при 0°С в течение