Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР

• Автор: Абрамова, Светлана Леонидовна
• Шифр специальности: 03.02.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 ГТЦР в диагностике фитопатогенов
1.1.1 Требования к характеристикам диагностических систем,
основанным на методе ПЦР
1.1.2 Возможные ошибки и ограничения в применении метода
ПЦР для диагностики фитопатогенов
1.2 Метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH
1.3 Краткая характеристика биологических свойств и
вредоносности грибов, являющихся объектами
исследования, и трудности их идентификации
1.4 Системы идентификации исследуемых видов, основанные
на методе ПЦР
1.4.1 ПЦР-системы для идентификации видов S. tritici и S.
nodorum
1.4.2 ПЦР-системы для идентификации видов F. graminearum, F.
culmorum, F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. tricinctum, F.
poae, F. langsethiae
1.4.3 ПЦР-системы для идентификации видов P. striiformis и P.
gram inis
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2 Методы
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Разработка системы идентификации видов S. tritici и S.
nodorum
3.1.1 Подбор праймеров для идентификации видов S. tritici и S.
nodorum и проверка их видоспецифичности

3.1.2 Подбор и проверка ПЦР-зонда для флуоресцентной
детекции видов S. tritici и S. nodorum
3.2 Разработка системы идентификации грибов рода
Fusarium
3.2.1 Подбор праймеров для идентификации видов F.
graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae и проверка их видоспецифичности
3.2.2 Подбор и проверка ПЦР-зондов для флуоресцентной
детекции видов рода Fusarium
3.3 Подбор праймеров для идентификации видов Р. graminis и
Р. striiformis и проверка их видоспецифичности
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Та - температура отжига олигонуклеотида.
Тт — температура плавления олигонуклеотида.
ITS — Internal transcribed spacer (внутренний транскрибируемый с пейс ер).
tefla - Tranclation elongation factor 1-alpha (фактор элонгации трансляции 1-альфа). рРНК - рибосомалъная РНК. fl-tub — ген р-тубулина.
ГенБанк — база данных GenBank
dNTPs - deoxyribonucleotides (дезоксинуклеотидтрифосфаты).
ВК — внутренний контроль.
FLASH — Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization (качественная флуоресцентно-гибридизационная полимеразная цепная реакция).
К- - отрицательный контроль.
К+ - положительный контроль.

Таблица 5. Праймеры, подобранные для молекулярной идентификации
видов S. tritici и S. nodorum
Вид Об ласть гено ма Назва ниє Последовательность (51—>3') Tm Амп ли кон, п.н.
S. tritici fЗ-tub StTubr TTGAAGATGTCGTCCACCTTCGT' 70.6
S. nodorum SnTubr TCTCAAGATGTCCGCCACCTTC1 71.0
S. tritici, S. nodorum STubf TTCGACCCCAAGAAATGATGG1 71.5
S. tritici STtubFs AACATGATGGCCGCCAGC2 69.3
S. tritici STtubRs GAAGGTGGACGACATC ГТСААТ2 65.4
S. nodorum SNtubFs CAAGAACATGATGGCTGCCTCT2 68.9
S. nodorum SNtubRs AGGTGGCGGACATCTTGAGA 2 67.2
S. tritici pPIIK StITSFl TCCGACCTCCAACCCTTTGTG1 71.6
S. nodorum SnITSFl TATCCACCCTTGTCTTTTGCGG1 71.2
S. tritici StITSf2 ACCTCCAACCCTTTGTGAACACA2 70.4
S. nodorum SnITSf2 GTATAGCGCAAGCTGATGAGCAG2 69.5
S. tritici, S. nodorum SITSR GCAATGTGCGTTCAAAGATTCG1'2 70.4
S. tritici STitsFs CTCCAACCCTTTGTGAACACA3 65.3
S. nodorum SNitsFs TATAGCGCAAGCTGATGAGCAG3 65.6
S. tritici, S. nodorum SitsRs GCAATGTGCGTTCAAAGATTC3 65.5
Примечания: 1, 2, 3 — пары праймеров. Жирным шрифтом выделены праймеры, выбранные для разработки системы идентификации в формате FLASH. Tm рассчитана в программе Oligo 6.71.
Первые пары праймеров к гену р-шЬ представлены общим для двух видов прямым праймером вШЬР и индивидуальными обратными праймерами 8ТГиЬЯ и 8пТиЬЯ для видов 5. 1пПс1 и 5. nodorum, соответственно (рис. 1).
AJ310917_St AY786331_Sn AY78 6335_Sn AY786334 Sn
AJ310917_St AY786331_Sn AY78 6335_Sn AY786334 Sn
1261 STubF 1320
(1258) TCTTt С OAGC T T
(1091) TGT’TCGAC ТТГ.ТААЗААСАГСАТсТ 11T GC TCTСACT IС' : A' AA : 1:: СGGTAC : GAC T
( 10 90) iGT Г"~'GAT T у. AA .r.-GGTT ЗА T - ~ T ~:T /TCTGACTТCGG . С
(1090) fGT Г С GAC A С C/GAGA AC Ai GA,V ,A T" : TCT A .C ICGCAACGGl С G
1441 StTubR 1500
(1438) TGT Т:Т irAT’TCCTGACCGT":TATTGAAGAl’GTCGTCCACCTTCG1^1 )G 1СААГТССАСАТ (1271) С GIGGCCTGG^ VTG :TCTCAAGATGTCC<3CCACCTTC : • -T G
(127 0) CTGCTCCG7GC :CG -G A TG' :TCTCAAGATGTCCGCCACCTTCGTCGTTaA. ITA.C A ACT
SnTubR
Рис. 1. Выравнивание последовательностей нуклеотидов участка гена /З-ШЬ Локализация первых праймеров выделена подчеркиванием. В кодах выравниваемых последовательностей вп обозначает по^гит, 81