Анализ транскрипции ретротранспозонов группы gypsy в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco

• Автор: Урусов, Феликс Анатольевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

Список сокращений
1. Ретротранспозоны дрозофилы и механизмы регуляции их активности (обзор литературы)
1.1 Общие представления о мобильных генетических элементах (МГЭ)
1.2 Класс ДНК-транспозонов
1.3 Класс ретроэлементов
1.4 Ретротранспозоны группы gypsy D. melanogaster
1.5 Общие представления об РНК-интерфренции
1.6 Контроль активности МГЭ в яичниках дрозофилы, обеспечиваемый короткими piPHK
1.7 Piwi - ключевой полифункциональный компонент piPHK пути
1.8 Взаимосвязь процессов РНК-интерференции и регуляции состояния хроматина в осуществлении контроля МГЭ
1.9 Геномные кластеры piPHK
1.10 Локус flamenco - основной источник piPHK в соматических клетках яичников
2. Материалы и методы
2.1 Линии D. melanogaster и условия их культивирования
2.2 Сбор тканей для последующего выделения РНК
2.3 Выделение геномной ДНК
2.4 Выделение тотальной РНК
2.5 Синтез кДНК
2.6 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
2.7 Полимеразная цепная реакция
2.8 Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле
2.9 Вычитающая гибридизация (ВГ)
2.10 Секвенирование ДНК
2.11 Биоинформатический анализ
3. Результаты и обсуждение
3.1. Исследование экспрессии на уровне транскрипции МГЭ группы gypsy в линиях MS и SS
3.2. Структурно-функциональный анализ МГЭ Tirant в линиях, мутантных по локусу flamenco
3.2.1. Исследование транскрипции МГЭ Tirant
3.2.2. Анализ 5'-нетранслируемой области Tirant
3.2.3. Исследование транспозиционной активности Tirant
3.2.4. Скрещивание изогенных линий 7Kw' и 7К(1), анализ экспрессии Tirant у потомства
3.3. Гибридологический и молекулярный анализ взаимодействия flamenco и piwi
3.3.1. Скрещивание линий MS и SS с линией piwi
3.3.2. Индивидуальные скрещивания линии SS с piwi
3.3.3. Анализ экспрессии ретротранспозона gypsy в яичниках гибридов первого поколения
3.3.4. Экспрессия gypsy в семенниках гибридов первого поколения
3.3.5. Анализ экспрессии ретротранспозона Idefix в семенниках гибридов первого поколения
Заключение
Благодарности
Список литературы
Приложение

Список сокращений
DEPC - diethylpyrocarbonate
LINE - long interspersed nuclear elements
SINE - short interspersed nuclear elements
ДКП - длинные концевые повторы
МГЭ - мобильные генетические элементы
HEPES - 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid
EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid
ВГ - вычитающая гибридизация
OPC - открытая рамка считывания
РНК - рибонуклеиновая кислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
piPHK - PlWI-interacting РНК
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Piwi - P-element induced wimpy testis
MS - mutator strain
SS - stable strain
кДНК - комплементарная ДНК тыс. - тысяча п.н. - пары нуклеотидов Grp - gag related protein
МДГ - мобильный диспергированный элемент ОТ - обратная транскриптаза/обратная транскрипция тРНК - траснпортная РНК РНКи - РНК-интреференция miPHK - microPHK
RISC - RNA-induced silencing complex АТФ - аденозинтрифосфат siPHK- short interferring PHK

[Smothers, Henikoff, 2001]. Считается, что каждый из паралогов выполняет свою специфичную функцию. Два из них - Hpld и Hple экспрессируются в герминальных тканях самок и самцов соответственно [Vermaak et al., 2005]. Фенотип мутантов по гену rhino (Hpld) очень похож на фенотип мутантов по генам Piwi-пути: мутации в гене rhino приводят к стерильности у самок и дерепрессии широкого спектра МГЭ в герминальных тканях [Volpe et ah, 2001; Klattenhoff et ah, 2009]. Интересен тот факт, что мутация rhino приводит к дерепрессии только мобильных элементов. Уровень экспрессии остальных клеточных генов, включая те гены, которые локализованы в гетерохроматине, оставался одинаковым как у контрольных, так и у мутантных по rhino мух [Klattenhoff et ah, 2009]. Это значит, что функция данного паралога Нр1 была адаптирована под тканеспецифичный конроль МГЭ.
Среди указанных паралогов одним из первых был описан белок Hpla (heterochromatin protein la) [James, Elgin, 1986]. В отличие, например, от rhino, он функционирует во многих тканях и принимает участие в регуляции не только МГЭ, но многих клеточных генов, поскольку «выключение» гена Su(var)-2-5, кодирующего данный белок (Hpla), является летальным [Eissenberg, Hartnett, 1993].
Hpla взаимодействует как с гистоном НЗ, ди- и триметилированным по лизину К9 (H3K9me2/3 - маркер неактивного хроматина), так и с его метилазой -Su(var)3-9, что по-видимому способствует метилированию соседних гистонов и распространению гетерохроматина [Lachner et ah, 2001]. Таким образом, локализация Hpla на хромосоме совпадает с районами метилированного гистона НЗ (НЗК9те). В работе Rangan et ah, 2011 было установлено, что 90% метки НЗК9те в яичниках дрозофилы, приходится на транспозоны и другие высокоповторяющиеся последовательности. Это является необходимым условием для нормального протекания оогенеза.
Показана способность белков Нр1 взаимодействовать с последовательностями МГЭ при формировании теломер у дрозофилы [Perrini et