Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на раннее эмбриональное развитие человека

• Автор: Шильникова, Евгения Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Основные этапы сперматогенеза человека
1.2. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов в сперматозоидах
1.3. Методы оценки состояния мужской фертильности
1.4. Генетические причины мужского бесплодия
1.4.1. Нарушения кариотипа
1.4.2. Микроделеции Y хромосомы
1.4.3. Микроделеции генов аутосомной локализации и генов хромосомы X
1.4.4. Нарушение расхождения хромосом в мейозе
1.5. Структурно-функциональные особенности генома сперматозоида
1.5.1. Нарушение компактизации хроматина созревающего сперматозоида
1.5.2. Повреждение ДНК сперматозоида в результате действия АФК
1.5.3. Апоптоз в процессе сперматогенеза
1.5.4. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение, качество эмбрионов и наступление беременности в программах ВРТ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1. Материал
2.2. Методы
2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови
2.2.2. QFH - окрашивание препаратов метафазных хромосом
2.2.3. Флуоресцентная гибридизаця in situ
2.2.4. Спермиологический анализ
2.2.5. Методика приготовления препаратов из эякулята
2.2.6. Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling)
2.2.7. Предобработка препаратов из эякулята для иммунуцитохимической детекции 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с помощью антител
2.2.8. Иммунуцитохимическая детекция 5МеС и 5hMeC с помощью антител на препаратах из эякулята
2.2.9. Анализ препаратов
2.2.10. Статистический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Анализ кариотипа пациентов с нарушением фертильности
3.2. Спермиологический АНАЛИЗ У пациентов с нарушением фертильности
3.2.1. Повторный спермиологический анализ у пациентов с нарушением фертильности
3.2.2. Спермиологический анализ для пациентов с аномалиями кариотипа
3.3. Оценка качества культивируемых in vitro эмбрионов и частоты появления эмбрионов с хромосомным дисбалансом у пациентов с аномалиями кариотипа
3.4. Анализ морфологии головок эякулированных сперматозоидов пациентов с нарушением фертильности
3.5. Анализ фрагментация ДНК сперматозоидов при нарушении фертильности
3.5.1. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов с учетом формы их головки.
3.5.2. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения и качество эмбрионов, культивируемых in vitro
3.6. Иммунодетекция 5-МеС и 5-нМеС в сперматозоидах из эякулята пациентов с нарушением фертильности
3.7. Сопоставление уровня фрагментации с уровнем гидроксилирования ДНК сперматозоидов в эякуляте пациентов с нарушением фертильности
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ А

ВВЕДЕНИЕ
Нарушение сперматогенеза - одна из основных причин бесплодия, частота которого во многих странах, в том числе и в России, достигает 15% (WHO, 2010). При этом вклад мужского фактора в его этиологию составляет 50-60% (WHO, 2010).
В последние десятилетия отмечается значительное ухудшение качества эякулята (Slama et al., 2002; Cooper et al., 2010; Jorgensen et al., 2011; Rolland et al., 2013). Согласно данным Международного андрологического конгресса в большинстве случаев нарушение фертильности у мужчин сопровождается снижением показателей спермиологического анализа (Dohle et al., 2010; Jungwirth et al., 2013). Так, согласно проведенным исследованиям, среднее значение концентрации сперматозоидов в эякуляте за последние десятилетия снизилось практически в 1,5 раза (Carlsen et al., 1992; Cooper et al., 2010). В последнем руководстве Всемирной Организации Здравоохранения по исследованию и обработке эякулята человека референсные значения основных показателей спермограммы: концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, существенно снижены (WHO, 2010).
К нарушению такого сложного и многоэтапного процесса, как сперматогенез, приводят как наследственные, так и экзогенные факторы. Среди наследственных факторов выделяют нарушения кариотипа, в том числе числовые и структурные аномалии. Хромосомные перестройки затрудняют расхождение хромосом в мейозе, что приводит к снижению спермопродукции, и как следствие, нарушению фертильности. В то же время у носителей структурных аномалий кариотипа повышена частота образования несбалансированных гамет, которые могут принять участие в оплодотворении, увеличивая вероятность появления эмбрионов с хромосомным дисбалансом. Поэтому своевременный анализ кариотипа позволит скорректировать стратегию преодоления бесплодия. Другой причиной снижения фертильности у мужчин являются микроделеции Y хромосомы в локусе AZF. Известно так же, что сперматогенез контролируется более 2 000 генов, мутации в которых могут приводить к нарушениям процесса на том или ином этапе. Таким образом, генетические факторы обуславливают до 10-15%, а по некоторым данным до 50%, случаев нарушения сперматогенеза (Ferlin et al., 2007; Ferlin, 2012).
Немаловажную роль в нарушении сперматогенеза играют факторы внешней среды, такие как курение, ожирение, стресс. Неблагоприятные факторы внешней среды приводят к образованию активных форм кислорода (АФК) в клетке, и, как следствие, могут быть причиной окислительного стресса. Последний, в свою очередь, напрямую связан с

Замещение гистоновых белков на протамины сопровождается разрезанием и последующим восстановлением структуры ДНК. Топоизомераза II является эндогенной нуклеазой, которая вносит разрывы в ДНК, необходимые для снятия торсионного напряжения, а также обеспечивает последующее лигирование ДНК с образованием промежуточной структуры - интермедиата (фермент + 5' конец ДНК) (McPherson and Longo, 1993). Поскольку сперматиды являются гаплоидными клетками, то репарация разрывов ДНК по типу гомологичной рекомбинации из-за отсутствия сестринской хроматиды невозможна. Вероятно, репарация повреждений ДНК происходит иными путями, например, с помощью негомологичного воссоединения концов (NHEJ), однако точные пути репарации ДНК в сперматидах до сих пор остаются неизученными (Zini and Agarwal, 2011).
В норме в придатке яичка в ходе дозревания сперматозоида целостность ДНК полностью восстанавливается. Наличие разрывов в ДНК сперматозоида после дозревания в придатке яичка свидетельствует о нарушении упаковки ДНК и незавершенности процесса дозревания гаметы (Erenpreiss et al., 2001).
Нарушение процесса замены гистонов на протамины, а также изменение соотношения протаминов разных типов приводит к снижению фертильности (Carrell et al., 2007).
Нерепарированные разрывы ДНК нарушают структуру хроматина половой клетки, делают ее более чувствительной к действию повреждающих агентов. Например, показано, что употребление алкоголя и курение приводит к увеличению доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК (Zini and Agarwal, 2011).
1.5.2. Повреждение ДНК сперматозоида в результате действия АФК
Окислительный стресс представляет собой процесс повреждения клетки продуктами окисления — ROS (reactive oxygen species). ROS или Активные Формы Кислорода (АФК) -метаболиты, возникающие в результате восстановления молекулярного кислорода. АФК являются основными компонентами, участвующими в нарушении окислительно -восстановительного статуса клетки. К АФК относят супероксид 02 пероксид водорода НгСЬ, пероксильные радикалы ROO, гидропероксид ROOH, пероксинитриты ONOO-, оксид азота (II). АФК могут взаимодействовать друг с другом, например, при взаимодействии 02" и Н2О2 в присутствии металлов, железа или меди, которые могут менять свою валентность, происходит образование Ог’. АФК способны эффективно окислять белки, липиды и