Генетическая характеристика спонтанно трансформированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека

• Автор: Омельченко, Денис Олегович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 198 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Цели и задачи
Научная новизна и практическая значимость
Положения, выносимые на защиту
Степень достоверности и апробация результатов
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки
1.2. Происхож-дение ММСК
1.3. Цитогенетические исследования ММСК
1.4. Роль ММСК из разных источников в возникновении сарком мягкихтканей
1.5. Исследования профиля экспрессии ММСК
1.6. Генная инженерия ММСК
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клеточные культуры и условия культивирования
2.2. Подсчет концентрации клеток в суспензии в камере Горяева
2.3. Криоконсервация и разморозка клеточных культур ММСК ЖТ
2.4. Получение моноклональных культур спонтанно трансформированных ММСК ЖТ
2.5. Цитогенетическое исследование спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека
2.5.1. Приготовление препаратов ругинно окрашенных метафазных пластинок
2.5.2. Исследование рутинно окрашенных метафазных пластинок
2.5.3. Статистический анализ данных цитогенетического исследования
2.6. Сравнительный парный анализ транскриптома спонтанно трансформированных и нормальных ММСК ЖТ человека
2.6.1. Подготовка образцов клеточных культур трансформированных и нормальных ММСК ЖТ человека для выделения тотальной РНК
2.6.2. Выделение тотальной РНК из образцов клеточных культур
2.6.3. Амплификация и измерение концентрации тотальной РНК
2.6.4. Гибридизация биотинилированной кРНК на микрочине lllumina
2.6.5. Обработка первичныхданных по интенсивности флуоресценции зондов перед статистическим анализом
2.6.6. Определение ди()х[>еренц11апыю экспрессированныхтранскриптов с помошыо алгоритма Significance analysis ofmicroarrays (SAM)
2.6.7. Функциональный анализ дифференциально экспрессированных между образцами транскриптов
2.7. Исследование стабильной лентивирусной трансдукции спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека
2.7.1. Отбор культуры клеток трансформированных ММСКЖТ, способной к росту на бессывороточной среде
2.7.2. Лентивирусная трансдукция спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека
2.7.3. Селекция флуоресцентных клеток после трансдукции
2.7.4. Проточная цитометрия спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека
2.7.5. Выделение ДНК из клеточных культур
2.7.6. Точное определение концентрации выделенной ДНК
2.7.7. Измерение копийности трансгена в трансдуцнрованных клетках
2.7.8. Выделение белка TagGFP2 из трансдуцнрованных клеток
2.7.9. Измерение концентрации белка TagGFP2 в трансдуцнрованных клетках
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Цитогенетическое исследование
3.1.1. Хромосомный набор культур спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека
3.1.2. Хромосомные аберрации в культурах спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека
3.2. Сравнительный парный анализ транскриптома нормальных и спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека
3.2.1. Подготовка данных для анализа
3.2.2. Определение дифференциально экспрессированных транскриптов с помощью алгоритма Significance analysis of microarrays (SAM)
3.2.3. Связь дифференциальной экспрессии транскриптов с результатами цитогенетического анализа
3.2.4. Функциональный анализ наиболее значимо изменившихся по экспрессии транскриптов
3.2.5. Разнонаправленное изменение экспрессии транскриптов одного гена
3.2.6. Групповой функциональный анализ дифференциально экпрессированных генов
3.3. Оценка потенциала спонтанно трансформированных ММСК ЖТ человека к стабильной генетической модификации
3.3.1. Отбор культуры клеток трансформированных ММСК ЖТ, способной к росту на бессывороточной среде
3.3.2. Трансдукция культуры клеток спонтанно трансформированной культуры ММСКЖТ человека VA18 2 лентивирусным вектором с репортерным геном TagGFP
3.3.3. Анализ стабильности трансдукции и экспрессии трансгена при длительном культивировании трансформированных ММСК ЖТ человека VA18_
3.3.4. Селекция клеток трансформированных ММСК ЖТ человека VA18_2, стабильно трансдуцнрованных лентивирусным вектором с репортерным геном TagGFP2
3.3.5. Количественная оценка копийности трансгена в клетках трансдуцнрованных моноклональных культур VA2GFP_lk, VA2GFP_2k, VA2GFP_3k и VA2GFP_4k при длительном пассировании
3.3.6. Количественное определение продукции трансгенного белка TagGFP2 в клетках моноклональных культур VA2GFP_lk, VA2GFP_2k, VA2GFP_3k и VA2GFP_4k после трансдукции лентивирусным вектором pLVT-TagGFP2-N при длительном культивировании
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани (ММСК ЖТ) - это перспективный и популярный объект для генной инженерии и клеточной терапии, благодаря наименее инвазивному способу получения в достаточно больших для культивирования и трансплантации объемах.
Одним из важных вопросов при использовании стволовых клеток для терапии является их безопасность в отношении риска неопластической трансформации при выделении и ведении ex vivo. В процессе культивирования ММСК претерпевают изменения, в результате которых наступает клеточное старение и остановка деления. Неизбежно появляющиеся в ходе культивирования мутации могут привести к неопластической трансформации клеток. Поэтому при культивировании ММСК перед трансплантацией необходимо быть уверенным, что клетки не изменили своего фенотипа и не накопили мутации, способные инициировать неопластическую трансформацию и дать начало онкологическому заболеванию в организме после трансплантации.
Многочисленные исследования ММСК человека показывают противоречивую картину относительно вопроса оценки риска их спонтанной трансформации in vitro [Bentivegna A. etal., 2013].
Большинство исследователей склоняются к мнению, что ММСК человека гораздо больше генетически устойчивы ex vivo, чем например мышиные ММСК, и в культуре без дополнительной серии онкогенных стимулов не трансформируются [Lund R.J. et al., 2012].
Описанные в литературе случаи, когда человеческие ММСК претерпевали спонтанную трансформацию в культуре, приобретали свойства и фенотип неопластических клеток и вызывали новообразования при трансплантации в животных моделях, редки. Есть ряд работ, в которых описано явление спонтанной

Для трансфекции ММСК применяют разные методы [Vargas А.Е. et al., 2012]. Их можно разделить на две больших группы - вирусные и невирусные способы доставки трансгена. Невирусные методы трансфекции, основанные на доставке плазмиды с трансгеном в целевую клетку с помощью химических реагентов или электропорации отличаются безопасностью, низкой иммуногенностыо и большой вместимостью плазмиды. Недостатком является неспецифичность связывания и как следствие низкая эффективность доставки трансгена.[Ь Santos J. et al., 2011; Madeira C. et al., 2010; L Santos J. et al., 2011; Eisler S. et al., 2012; Flanagan M. et al., 2012; Hu Y. et al., 2013]. Нескольким коллективам исследователей в недавно опубликованных работах удалось преодолеть недостаток низкой эффективности невирусной трансфекции, оптимизировав ее условия [Helledie Т. et al., 2008; Boura J.S. et al., 2013], что позволяет повысить эффективность.
Вирусные методы трансфекции характеризуются высокой эффективностью, возможностью получать как транзиентную, так и постоянную экспрессию трансгена. При этом вирусные вектора имеют потенциальную патогенность, риск онкогенной трансформации, способны вызывать иммунный ответ [Zhang X. & Godbey W.T., 2006].
Трансдукцию ММСК проводят разными вирусными векторами: аденовирусными [Тгеасу О. et al., 2012; Li J.F. et al., 2013; Du Z. et al., 2013], адено-ассоциированными [Lu L. et al., 2005; Locke M. et al., 2011], онкорегровирусными и лентивирусными [Morizono K. et al., 2003; Schierling W. et al., 2008]. Наибольшую популярность завоевал метод трансдукции рекомбинантными лентивирусными векторами, благодаря их высокой эффективности, широкому тропизму, способности интегрировать трансген в геном целевой клетки и стабильно его экспрессировать па терапевтическом уровне [McGinley L.M. et al., 2011; Moriyama H. et al., 2013]. Сейчас самыми распространенными векторами являются лентивирусные вектора с сильными промоторами (например цитомегаловирусный промотор CMV), или лентивирусные вектора с EFl-a промотором [Xia X. et al., 2007; VarmaN.R.S. et