Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов

• Автор: Гридина, Мария Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Эмбриональные стволовые клетки
1.1.1. Рост ЭС клеток в культуре
1.1.2. Способы оценки плюрипотентности ЭС клеток
1.1.3. Внешние факторы, необходимые ЭС клеткам
1.1.4. Транскрипционные факторы, регулирующие плюрипотентное состояние ЭС клеток
1.1.5. Эпигенетическая регуляция плюрипотентности
1.1.5.1. Организация хроматина в ЭС клетках
1.1.5.2. Метилирование ДНК в ЭС клетках
1.1.5.3. Состояние Х-хромосом в ЭС клетках
1.2. Репрограммирование геномов соматических клеток через слияние с ЭС клетками
1.2.1. Метод слияния клеток
1.2.2. Гибридные клетки между ЭС клетками и соматическими клетками
1.2.2.1. Потенциал гибридных клеток между ЭС клетками и соматическими клетками
1.2.2.2. Профиль экспрессии генов в гибридных клетках
1.2.2.3. Эпигенетическое состояние генома гибридных клеток
1.2.3. Для репрограммирования генома соматической клетки необходимо и достаточно ядро ЭС клетки
1.2.4. Ранние этапы процесса репрограммирования
1.2.4.1. Ранние этапы процесса перепрограммирования при слиянии двух соматических клеток
1.2.4.2. Ранние этапы процесса репрограммирования при слиянии ЭС клеток и соматических клеток
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клетки и клеточные линии
2.2. Работа с культурами клеток
2.2.1. Условия культивирования клеток
2.2.2. Получение и культивирование клеточных культур и гибридных клеток
2.2.2.1. Получение культур первичных эмбриональных фибробластов
2.2.2.2. Культивирование фибробластов
2.2.2.3. Мечение цитоплазмы фибробластов с помощью флуоресцентных микросфер
2.2.2.4. Культивирование эмбриональных стволовых и гибридных клеток
2.2.2.5. Получение гибридных клеток
2.2.3. Замораживание и размораживание клеток
2.3. Иммунофлюоресцентный анализ ЭС клеток, фибробластов и гибридных клеток
2.4. Работа с ДНК
2.4.1. Выделение геномной ДНК из культивируемых клеток
2.4.2. Выделение геномной и митохондриальной ДНК из единичных клеток
2.4.2.1. Сбор материала
2А.2.2. Выделение ДНК единичных клеток

показал, что изменения экспрессии генов начинаются через 6 часов после слияния и продолжаются в течение четырех дней. Как и ожидалось, после слияния происходит активация экспрессии человеческих генов, характерных для мышечных клеток, то есть активация экспрессии «мышечных» генов в геноме кератиноцита, и прекращение экспрессии кератиноцит-специфичных генов. Однако при проведении дальнейших анализов гетерокарионов также было обнаружено, что в геноме миобласта мыши происходит активация экспрессии кератиноцит-специфичных генов, то есть происходит изменение программы не только ядра кератиноцита, но и ядра миобласта.
Существует общепризнанная гипотеза, что изменение программы должно быть однонаправлено, так как существуют некие доминирующие фенотипы клеток, при слиянии с такими клетками любых других клеток происходит перепрограммирование последних в сторону доминирующего фенотипа. Мышечные клетки до сих пор считали примером такого доминирующего фенотипа, однако, в данном случае происходит взаимное влияние двух геномов - изменение профиля экспрессии генов как кератиноцита, так и миобласта. Из проведенного транскриптомного анализа не было ясно, происходят ли эти два события одновременно в одном и том же гетерокарионе, или же существуют две популяции гетерокарионов. Изучая этот вопрос, основываясь на особенностях морфологии, авторы разделили популяцию гетерокарионов: одна группа представляла собой вытянутые, похожие на миотрубочки клетки, имеющие на своей поверхности маркер мышечных клеток NCAM, тогда как клетки второй группы были распластанные, с большим количеством отростков, ядрами, кластеризованными в центре и эти клетки не экспрессировали NCAM. Благодаря тому, что гетерокарионы только одной из популяций содержали на своей поверхности NCAM, было возможно, используя FACS методику, разделить эти две популяции и провести анализ экспрессии генов отдельно в каждой из них. В гетерокарионах NCAM-позитивной популяции происходила экспрессия и других генов, характерных для мышечных клеток, в геноме кератиноцита, но было лишь незначительное количество транскриптов, характерных для кератиноцитов, считывающихся с генома миобласта. В