Взаимодействие между N- и C-доменами белка Sup35 в процессе прионизации в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Сопова, Юлия Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 160 с. : ил.

Оглавление.
Обозначения и сокращения
Введение
1. Прионы низших эукариот (обзор литературы)
1.1.Общие свойства
1.2. Прионы мицелиальных грибов
1.3. Фактор [URE3]
1.4. Факторы [7SP+], [SWf], [МОТЗ+], [ОУГ] и МСЛ
1.5. Фактор [PS74]
1.6 Фактор [Р/У]
1.7. Зависимость проявления и поддержания [PSf ] от различных белков
1.8. Изгнание [P.S71] под действием хлорида гуанидина и его механизмы
1.9. «Жизненный цикл» прионов
1.10. Изменения в структуре Sup35, влияющие на разные стадии «жизненного цикла» [.Р57+]
1.10.1. Изменения, влияющие на стадию инициации
1.10.2. Изменения, влияющие на стадию конверсии (передачи прионной конформации)
1.10.3. Изменения, влияющие на стадию образования прионных «семян»
1.11. Прионизация гомологов белка Sup35 в дрожжах S. cerevisiae
1.12. Химерные конструкции, включающие различные домены белка Sup
2. Постановка задачи работы
3. Материалы и методы
3.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.2. Штаммы Esherichia coli
3.3. Плазмиды
3.4. Среды и условия культивирования
3.5. Учет фенотипов
3.6. Стандартные генетические методы
3.7. Элиминация [PST4"] и [PS/l-подобных факторов
3.8. Индукция экспрессии генов под контролем промотора CUP
3.9. Молекулярно-генетические методы
3.10. Методы микроскопирования
3.11. Получение белковых экстрактов для электрофореза в полиакриламидном геле
3.12. Получение белковых экстрактов для электрофореза в агарозном геле
3.13. Иммуноблотинг
4. Результаты
4.1. Получение трансгенных штаммов, несущих в хромосоме ген SUP35SP или sup35SP-
4.2. Фенотипическое проявление рекомбинантных генов SUP35SP и sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae
4.3. Нонсенс-супрессия у трансформантов трансгенных штаммов с геном SUP35SP в хромосоме
4.4. Нонсенс-супрессия у трансформантов трансгенных штаммов с геном sup35SP-275 в хромосоме
4.5. Нонсенс-супрессия у трансформантов нетрансгенных штаммов
5.cerevisia e
4.6. Агрегация белков Sup35SP и Sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae
4.6.1.Иммунологическое исследование агрегации
4.6.2.Цитологическое исследование агрегации белков Sup35SP и Sup35SP-
4.7. Влияние изменения экспрессии гена Н8Р104 на эффективность супрессии и агрегации белка 8ир358Р у трансгенных штаммов с генами УНРЗЗАР и 5ир355Р-275 в хромосоме

4.8. Изучение агрегации белка 8ир358Р-ОРР и состава агрегатов,
возникающих в клетках с полноразмерным 81/Р35 при экспрессии 8ИР358Р
4.8.1. Визуализация агрегатов с помощью флуоресцентной микроскопии
4.8.2. Оценка супрессии у трансформантов штамма 74-Д694 плазмидами, содержащими химерные гены 5,С/Р355'-(тРР, 8иР358Р-СРР и зир358Р-275-СРР
4.8.3. Изучение состава агрегатов, образующихся при экспрессии гена 81РР358Р в нетрансгенных штаммах, с помощью Вестерн-блот гибридизации
4.8.4. Конструирование штаммов, несущих ген 811Р35-НА в хромосоме, и изучение состава агрегатов, образующихся при экспрессии гена 81/Р358Р в таких штаммах
4.9. Изучение влияния экспрессии гена Н8Р104 на поддержание [Р£/+]5Л!5Л
4.9.1. Эффект сверхэкспрессии гена Н8Р104 на поддержание [Р£Р]Л/У
4.9.2. Эффект умеренной сверхэкспрессии гена Н8Р104 на поддержание
[Р5/‘]5га
4.10. Оценка зависимости поддержания [Р57+]л/’л от приона [Р/Л'1]
4.11. Индукция и поддержание фактора [РбД]5^' у диплоидных штаммов..
4.12. Летальное взаимодействие факторов [Р571"] и [Р5'/1]Л7>/У с мутантной
аллелью 5прЗ 55Р-2
5. Обсуждение
Выводы
Список литературы

выявления прионизации — теряющими свою активность (легко выявляемую фенотипически) при переходе в агрегированную форму (Wickner et al., 2000). С помощью такого подхода могут быть выявлены белки, способные к прионизации, а также идентифицированы их участки, необходимые для процесса прионизации.
В одной из работ изучалась химерная конструкция (обозначенная NMGR), объединявшая N- и М-домены Sup35 с глюкокортикоидным рецептором крысы (Li and Lindquist, 2000). Глюкокортикоидный рецептор (GR) - транскрипционный фактор, регулируемый стероидами. Присоединение фрагмента Sup35 не блокировало транскрипционную активность рецептора: в клетках [psf] белки NMGR и GR проявляли одинаковый уровень активности. Были получены данные, свидетельствующие о том, что белок NMGR может взаимодействовать с Sup35 и включаться в процесс прионизации. Во-первых, в клетках [RS/ ] NMGR имел более низкую активность, чем в клетках [ртГ], и этот эффект не был связан со снижением уровня экспрессии гена, кодирующего этот белок (NMGR). Во-вторых, экспрессия NMGR в клетках psi] индуцировала образование [RS/^-подобного элемента. Прионную природу этого элемента подтверждает его изгнание на среде, содержащей 5 мМ ГГХ, и при сверхпродукции Hspl04. После потери [Р571"]-подобного элемента восстанавливалась транскрипционная активность, характерная для GR. В-третьих, трансформация клеток [RST"] многокопийными плазмидами, несущими NMGR, приводила к значительному снижению жизнеспособности клеток. Такой же эффект вызывает трансформация клеток [RS/*] многокопийными плазмидами, содержащими ген SUP35.
В работе, посвященной исследованию прионных свойств белка Rnql (Sondheimer and Lindquist, 2000), была использована конструкция (обозначенная RMC), кодирующая белок (Rmc), объединяющий Gln/Asn — богатый фрагмент Rnql с М- и С-доменами Sup35. Клетки штамма S.