Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках

• Автор: Баттулин, Нариман Рашитович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 103 с. : ил.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю О.Л. Серову за помощь в обсуждении результатов работы, а также М.В. Пузакову и А.Г. Мензорову за помощь в освоении методов. Автор благодарит Э.М. Баричеву, А.И. Шевченко,
Н.М. Матвееву, B.C. Фишмана, Н.В. Павлову, Д.Р. Баттулину и A.B. Смирнова за ценные советы и помотць в подготовке текста диссертации. Автор благодарит всех сотрудников лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН за создание доброжелательной атмосферы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
М.Плгарипотенгность клеток и репрограммнрование
1.2. Репрограммирование в нормальном развитии млекопитающих
1.2.1. Репрограммирование в раннем развитии млекопитающих
1.2.2. Репрограммнрование в гаметогенезе
1.3. Методы экспериментального репрограммирования генома
1.3.1.Репрограммирование генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер в энуклеированные ооциты
1.3.2. Репрограммнрование генома соматических клеток при образовании ИПС клеток
1.3.3. Репрограммнрование генома при слиянии соматических и плюрипотентных клеток
1.3.3.1. Гибридные клетки типа клетка эмбриональной карциномы - соматическая клетка
1.3.3.2. Гибридные клетки типа эмбриональная герминальная клетка - соматическая клетка
1.3.3.3. Гибридные клетки типа эмбриональная стволовая клетка - соматическая клетка
1.4. Репрограммнрование генома в гибридных клетках
1.5. Транскрипционные факторы - ключевые регуляторы плюрипотентного статуса клеток
1.6.1.ипип /1/С
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клетки и клеточные линии
2.2. Выделение ДНК
2.3. Работа с РНК
2.3.1. Выделение РНК
2.3.2. Обработка РНК ДНКазой
2.3.3. Синтез кДНК
2.4. Полимеразная цепная реакция
2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.7. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.8. Бисульфитное секвенирование ДНК
2.8.1 Бисульфитная модификация ДНК
2.8.2. ГГЦР с вложенными праймерами

2.8.3. Субклонирование фрагментов ДНК
2.9. Микробиологические методы
2.9.1. Приготовление компетентных клеток Е.соИ
2.9.2. Трансформация компетентных клеток Е.соИ
2.10. Выделение фрагментов ДНК из гелей
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Экспрессия генов - молекулярных маркеров плгорипотентностн Ос« и Ыапо% в гибридных клетках
3.2. Экспрессия молекулярного маркера дифференцированных клеток гена Ьт/ш в гибридных клетках
3.3. Поиск аллель-специфичных сайтов рестрикции для дискриминации транскриптов разного родительского происхождения
3.4. Экспрессия родительских аллелей гена Ос14 и 14апо% в гибридных клетках
3.6. Определение последовательности 5’-регуляторных областей генов Ос14, Nanog и Етпа М. сагоИ
3.7. Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена Ос14 в ЭС клетках и спленоцитах
3.8. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Ос14 в эмбриональных стволовых гибридных клетках
3.9. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Ос14 в тератомах, полученных из эмбриональных стволовых гибридных клеток
3.10. Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена А’пло в ЭС клетках и спленоцитах
3.11. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена в эмбриональных стволовых гибридных
клетках
3.12. Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена Ьпта в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных стволовых гибридных клетках
3.13. Экспрессия тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях взрослых химер
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

эпигенотипа, в результате чего происходит активация генов, характерных для ЭС клеток, и репрессия тимоцит-специфичных генов.
Другим важным фактором эпигенетической регуляции является метилирование ДНК. На сегодняшний день нет работ, в которых оценивалось бы глобальное изменение уровня метилирования ДНК при репрограммировании в гибридных клетках. Однако имеются сообщения об изменении метилирования промоторного региона гена Oct4. По данным Коуэна с соавторами (Cowan et al., 2005) гиперметилирование 6-ти CpG дуплетов в районе от -464 до +7 промотора Oct4 характерно для фибробластов, тогда как в ЭС клетках человека они неметилированны. В гибридных клетках типа ЭС - фибробласт цитозины этих островков были деметилированы. Сходные данные, о деметилировании ДНК в районе 5’-регуляторной области гена Oct4 тимоцита, были получены при изучении гибридных клеток типа ЭС - тимоцит методом метилчувствительной ПНР (Kimura et al., 2004). Стоит особо отметить, что в этих исследованиях не было возможности различить последовательности ДНК, пришедшие от разных родительских клеток, поэтому они не являются прямым доказательством изменения статуса метилирования ДНК соматического партнера.
Таким образом, суммируя данные о репрограммировании эмбриональных гибридных клетках можно сделать вывод о том, что масштабному репрограммированию подвергается только геном соматического партнера, тогда как геном ЭС клеток, по-видимому, не подвергается значительным изменениям. Иными словами, в эмбриональных гибридных клетках геном плюрипотентного партнера доминирует над геномом дифференцированного партнера.
1.5. Транскрипционные факторы — ключевые регуляторы плюрипотентного
статуса клеток
Процесс репрограммирования генома сопровождается изменением транскрипционной активности генов. Реактивируется комплекс генов, необходимых для поддержания плюрипотентного статуса и самообновления клеток. И наоборот, подвергаются репрессии гены, необходимые для выполнения специфических функций дифференцированной клетки.