Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты

• Автор: Стрельников, Владимир Викторович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 238 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Основные направления молекулярно-генетических исследований в онкологии
1.1.2. Хронология изучения соматических мутаций геномов злокачественных новообразований: технологии и достижения
1.1.2. Каталоги соматических мутаций геномов злокачественных новообразований
1.1.3. Часы молекулярной эволюции опухолей
1.1.4. Молекулярно-генетические изменения в тканях, окружающих опухоль. Теория полей канцсризации и её клинические приложения.
1.1.5. Низкоинвазивная пресимптоматическая молекулярная диагностика рака на материале периферической крови и других биологических жидкостей
1.1.6. Роль биологических микрочипов в изучении и диагностике злокачественных новообразований
1.2. Аномальное метилирование ДНК и другие эпигенетические маркеры канцерогенеза
1.2.1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез
1.2.2. Методы изучения эпигенетической патологии при канцерогенезе.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клинический материал
2.2. Забор крови, операционного и биопсийного материала
2.3. Выделение геномной ДНК

2.4. Обработка ДНК бисульфитом натрия
2.5. Электрофорез ПААГ
2.6. Модификация метода МЧФП
2.6.1. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.6.2. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) с использованием СО-богатых праймеров
2.6.3. Электрофорез в ПААГ
2.6.4 Ультратонкое окрашивание нитратом серебра
2.6.5. Амплификация фрагментов СрО-осгровков и определение нуклеотидной последовательности
2.6.6. Метил-чувствительная ПЦР со специфическими праймерами
2.6.7. Метил-специфическое секвенирование
2.7. Модификация метода АИМС
2.7.1. Ферментативный гидролиз ДНК
2.7.2. Лигирование с адаптерами
2.7.3. Полимеразная цепная реакция для метода АИМС
2.7.4. Фрагментный анализ продуктов АИМС
2.7.5. Рестриктазное картирование продуктов АИМС
2.7.6. Метилспецифическое секвенирование выявленных АИМС локусов
2.8. Исследование генов супрессоров опухолевого роста
2.8.1. Метил-чувствительная ПЦР со специфическими праймерами
2.8.2. Метил-специфическое секвенирование
2.9. Исследование молекулярной патологии гена БЕМАбВ
2.9.1. Выделение РНК из опухолевой и нормальной тканей
2.9.2. Синтез кДНК
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Непредвзятый скрининг дифференциального метилирования геномов
3.1.1. Метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП)

3.1.2. Современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов. Технология AFLOAT.
3.2. Локус-специфический анализ дифференциального метилирования геномов
3.2.1. Методы, основанные на применении метилчувствительных рестриктаз
3.2.2. Характеристика частот метилирования отдельных локусов генома, выявленных методами непредвзятого скрининга
3.2.3. Методология анализа бисульфит-конвертированной ДНК
3.2.4. Детальные карты дифференциально метилированных участков генома человека
3.3. Предвзятый подход к выявлению новых маркеров канцерогенеза, основанных на аномальном метилировании ДНК
3.3.1. Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе функций известных генов
3.3.2. Поиск кандидатных локусов для анализа дифференциального метилирования в областях потери гетерозиготности, характерных для отдельных типов опухолей
3.4. Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе локальных характеристик хроматина. Синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов
3.5. Изучение эпигенетической патологии семейства генов ламининов на основе синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

материалы достаточно удобными с точки зрения использования в лабораторной диагностике в онкологии. В то же время, подходы, основанные на анализе внеклеточной ДНК, не вошли в широкую клинико-диагностическую практику. Причиной этому послужили, главным образом, плохая сохранность и низкая концентрация фрагментов внеклеточной ДНК, осложняющие проведение исследований и снижающие чувствительность тестов.
Разработке более надежных диагностических тестов при сохранении низкоинвазивного характера забора биологического материала могло бы способствовать выявление молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием солидных опухолей, в лимфоцитах периферической крови. Такой подход обеспечил бы доступность для анализа достаточного количества неповрежденных молекул нуклеиновых кислот.
Недавние исследования показали принципиальную возможность использования транскриптомного анализа лимфоцитов периферической крови для определения генных профилей экспрессии, ассоциированных с наличием в организме онкологического процесса и с ответом па проводимую терапию. Такие исследования уже проведены на пациентах с раком почки, молочной железы, легкого и колоректальным раком (Burczynski et al., 2005; Han et al., 2008; Showe et al., 2009; Aaroe et al., 2010). В их основе лежит гипотеза, предполагающая, что опухолевый процесс провоцирует ответную реакцию циркулирующих лимфоцитов, приводя к заметным изменениям профилей экспрессии генов, определяемых в клетках периферической крови. Разработка специфических профилей экспрессии требует по возможности полного анализа транскриптомов значительного количества образцов периферической крови пациентов и практически здоровых доноров. Исследования такого рода осуществляются на технологической платформе биологических микрочипов.