Изучение стратегии экспрессии денсовируса рыжего таракана Blattella germanica

• Автор: Мартынова, Елена Уразовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 189 с. : ил.

Содержание
Список сокращений
Общая характеристика работы
Актуальность работы
Цели и задачи исследования
Научная новизна и практическая значимость работы
Апробация работы
Обзор литературы
I. Классификация и общая характеристика семейства Parvoviridae
II. Характеристика подсемейства Densovirinae
1. Общая характеристика и биология денсовирусов
а) Общие свойства денсовирусов
б) Распространенность денсовирусов
в) Патогенез дснсо вирусов
2. Классификация подсемейства Densovirinae
3. Генетически детерминируемая устойчивость к заражению у тутового шелкопряда
4. Белки денсовирусов
а) Белки капсида (структурные белки)
б) Неструктурные белки 3
5. Практическое использование денсовирусов
а) Использование в качестве векторов экспрессии
б) Использование денсовирусов в бологическом контроле
III. Рецепторы и проникновение в клетку
1. Парвовирусы позвоночных
2. Денсовирусы
IV. Общая схема репликации парвовирусов и репликация денсовирусов
V. Стратегии экспрессии вирусов подсемейства Densovirinae
а) Основненые особенности экспрессии генома денсовирусов
б) Стратегии экспрессии геномов денсовирусов
VI. Денсовирус рыжего таракана Blaltella germanica (ögDNV)
Материалы и методы
Микробиологические среды

Пересеваемая культура клеток рыжего таракана Blattelia germanica Условия содержания тараканов Blattelia germanica и заражение вирусом
RgDNV
Электрофорез
Экстракция нуклеиновых кислот фенол-хлороформом Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами Очистка фрагментов ДНК
Оценка качества и количества нуклеиновых кислот Выделение геномной ДНК фенольным методом Выделение геномной ДНК с использованием набора Diatom Prep Выделение плазмидной ДНК
Выделение плазмидной ДНК методом быстрого лизиса ПЦР с колонии для определения размера вставки Выделение плазмидной ДНК для секвеиирования Выделение тотальной РНК и РНК-электрофорез Нозерн-блот Авторадиография
Гибридизация с одночепочечными РНК-зондами Радиоактивномеченые зонды для гибридизации
а). Получение ДНК-зондов
б). Мечение ДНК-зондов
с). Получение радиоактвно-меченых РНК-зондов (рибопробы)
ПЦР с обратной транскрипцией Long-PCR
Быстрая амплификация концов кДНК (RACE)
Праймеры для амплификации и секвеиирования Клонирование ПЦР-продуктов
а). Вектор для клонирования
б). Подготовка клонируемых фрагментов
в). Лигирование
Приготовление химически компетентных клеток E.coli и трансформация Трансформация клеток E. coli и селекция колоний Секвенирование Очистка вирусных частиц
Выделение вирусной ДНК из вирусных частиц RgDNV

Электрофорез белков в полиакриламидном геле Масс-спектрометрический анализ белков Получение тотальных клеточных экстрактов
Получение ядерных и цитоплазматических экстрактов из клеток BGE-
Вестерн-блоттинг
Dot-б лотти нг
Иммунопреципитация
Иммунофлуоресцентный анализ локализации вирусных белков в клетках культуры BGE-
Биоинформатические ресурсы Результаты и обсуждение
I. Стратегия экспрессии генома BgDNV на уровне транскрипции
1. Динамика развития вирусной инфекции BgDNV в культуре клеток BGE-2 на уровне репликации
2. Определение профиля транскрипции и временной динамики синтеза вирусных мРНК
3. Построение транскрипционной карты денсовируса BgDNV
а). Характеристика транскриптов для капсидных и неструктурных белков
б). Обнаружение и характеристика дополнительной группы транскриптов для неструктурных белков
RT-PCR
Гибридизация
4. Определение точек начала и окончания транскрипции методом RACE
З’-RACE 5’-RACE
5. Установление природы группы дополнительных VP транскриптов
II. Изучение белков BgDNV
1 .Очистка вирусных частиц RgDNV
2.Изучение структурных белков денсовируса BgDNV
а) Идентификация структурных белков BgDNV
б) Western-блот анализ экспрессии белков капсида
в) Обнаружение убиквитинирования белка VP
г) Дополнительный 5’-RACE для изучения природы образования белка VP

б) Неструктурные белки
Представители различных родов денсовирусов содержат неодинаковое количество рамок считывания для неструктурных белков (2 либо 3). Наиболее вероятно, данные белки участвуют в репликации; и регуляции экспрессии вирусной ДНК, аналогично соответствующим белкам парвовирусов. В. то время как белок NS-1 является хорошо изученным даже у денсовирусов, практически: отсутствуют данные о структуре, функциях-, и роли; в, жизненном цикле для; остальных, неструктурных-белков. Белок-NS-1 . является,высококонсервативньтм, в то время-как остальные белки NS-2 ,и NS-3 выявляют гомологию- лишь среди представителей одного рода или: наиболее филогенетически близких представителей разных родов; Этот факт может говорить о том, что данные белки выполняют функции, которые: необходимы для жизненного цикла вируса, но в определенной степени продиктованы, спецификой , клетки-хозяина и установились в ходе эволюции данной конкретной группы вирусов.
ORF, кодирующие белок NS-2 разного размера- присутствуют в .геномах всех денсовирусов. В; работе Asarkh et al., 2008; впервые проведено изучение белка NS-2 у /leDNV (род Brevidensovirus). Было показано, что экспрессия этого белка начинается через ■ 12 ч. п.н. и постепенно нарастает к 24 ч п.и. В инфицированной: клетке белок-детектируется как в ядре, так и в цитоплазме, при этом-в ядре.он образует подобие ореола, (гало) с внутренней стороны ядерной мембраны. Внутриклеточное распределение белка зависит от времени п.и.: сначала он обнаруживается в ядре в виде небольших скоплений — ядерных телец, характерных для; парвовирусной инфекции (11 ч п.и.);, далее, начинает распространяться по ядру, при этом изменяется структура самих мест скопления белка, которые от овальных становятся-кольцеобразными (18 — 28 ч п.и.); наконец; начинает локализоваться в цитоплазме и'смещаться, на периферию ядра (28! - 37 ч. п.и.). В С-концевой- части белка был обнаружен двухчастный . сигнал ядерной локализации (KR(X)nKRRV), аналогичный сигнал бьш обнаружен и у других представителей рода Brevidensovirus. Использование рекомбинантных конструкций, содержащих геном HaeDNV без ORF, кодирующей NS-2, или содержащих геном HPeDNV, где в ORF, кодирующей NS-2, имелась точечная мутация в позиции 172, показало, что в первом случае происходит снижение синтеза вирусной ДНК и образующиеся вновь вирусные частицы становятся неспособными к заражению. Во втором случае хоть при трансфекции и не происходит изменения хода инфекции, но образующиеся вновь вирионы также не способны к заражению. Таким образом, данный белок необходим для эффективной репликации и накопления вирусного генома и формирования новых вирусов, способных к продуктивной инфекции, хотя точная функция его остается не выяснсной.