Физиологические основы регуляции синтеза антимикробных пептидов у Diptera, Calliphoridae на клеточном и организменном уровне

• Автор: Яковлев, Андрей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.02.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 143 с. : ил.

Оглавление
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Иммунная система насекомых
1.1.1. Распознавание «чужого»
1.1.2. Элиминация «чужого»
1.1.2.1. Фагоцитоз
1.1.2.2. Инкапсуляция и образование морул
1.1.2.3. Коагуляция гемолимфы
1.1.2.4. Цитотоксическая реакция
1.1.2.5. Меланизация
1.1.2.6. Антимикробные пептиды
1.2. Антимикробные пептиды насекомых
1.2.1. Структурное разнообразие антимикробных пептидов
1.2.1.1. Цекропины
1.2.1.2. Пептиды, содержащие дисульфидные связи
1.2.1.3. Пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами
1.2.2. Механизм действия антимикробных пептидов
1.2.3. Жировое тело и его роль в синтезе антимикробных пептидов
1.2.4. Другие источники антимикробных пептидов
1.2.5. Индукция синтеза антимикробных пептидов
1.2.6. Роль эпителия и гемоцитов в индукции синтеза антимикробных
пептидов клетками жирового тела
1.2.6.1. Роль эпителия в индукции синтеза пептидных антибиотиков
1.2.6.2. Роль гемоцитов в индукции синтеза пептидных антибиотиков
1.2.7. Синтез антимикробных пептидов у СаШрИога утпа
1.3. Взаимодействие иммунной и нейроэндокринной системы
1.3.1. Структурная организация нейроэндокринной системы
1.3.2. Основные гормоны насекомых
1.3.2.1. Экдистероиды
1.3.2.2. Ювенильный гормон
1.3.2.3. Адипокинетический гормон
1.3.2.4. Биогенные амины
1.3.3 Иммуно-нейроэндокринные взаимодействия

1.3.4. Влияние нейроэндокринной системы на иммунные процессы
у Calliphora vicina
1.3.5. Роль гормонов в регуляции иммунных процессов у насекомых
Глава II. Материал и методы
II. 1. Биологический материал
11.2. Методы
II.2.1. Микрохирургические вмешательства
И.2.1.1. Инфицирование насекомых
11.2.1.2. Наложение лигатур и термическое воздействие
11.2.1.3. Сбор гемолимфы и отделение плазмы
11.2.1.4. Отделение покровов
11.2.1.5. Выделение жирового тела
11.2.1.6. Определение жизнеспособности культивируемых клеток
И.2.2. Методы концентрации и очистки веществ
11.2.2.1. Избирательная денатурация под действием температуры
11.2.2.2. Метод твердофазной экстракции
11.2.2.3. Метод ультрафильтрации
11.2.2.4. Хроматографическое фракционирование
11.2.2.5. Масс-спектрометрия
11.2.3. Анализ антимикробной активности материала
11.2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных
Глава III. Индукция синтеза антимикробных пептидов in vivo
III. 1. Эффект инфицирования
111.2. Эффект стрсссорного воздействия
Ш.2.1. Эффект лигатурного стресса
III.2.2. Эффект термического ожога
111.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vivo
111.4. Заключение
Глава IV. Синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела in vitro
IV. 1. Разработка органной культуры жирового тела
IV.1.1. Выбор базового состава культуральной среды
IV. 1.2. Выживаемость культивируемых клеток
IV. 1.3. Индукция антимикробной активности in vitro
IV.1.3.1. Роль «фактора плазмы» в активации жирового тела
IV. 1.3.2. Роль «фактора покровов» в активации жирового тела

IV. 1.3.3. Роль гормонов в активации жирового тела
IV. 1.4. Стерилизация культуры жирового тела
IV. 1.5. Температура культуральной среды
IV. 1.6. Перемешивание культуры
IV. 1.7. Газообмен в культуре жирового тела
IV.1.8. Геометрические параметры культуральной ячейки
IV. 1.9. Продолжительность цикла культивирования
IV.2. Количественные характеристики метода получения антимикробных пептидов
in vitro
IV.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vitro
IV.4. Заключение
Глава V. Поиск факторов активации жирового тела и изучение их свойств
V.l. Термостабильность факторов активации жирового тела
V. 1.1. Термостабильность факторов активации, локализованных в плазме
V. 1.2. Термостабильность факторов активации, локализованных в покровах
V.2. Молекулярная масса факторов активации жирового тела
V.3. Хроматографические характеристики факторов активации жирового тела
V.4. Видоспецифичность факторов активации жирового тела
V.5. Заключение
Глава VI. Обсуждение
VI. 1. Травмогенная индукция синтеза антимикробных пептидов
VI.2. Нейрогенная индукция синтеза антимикробных пептидов
VI.3. Органная культура жирового тела в иммунологии и биофармакологии
насекомых
VI.3.1. Органная культура жирового тела как инструмент для изучения механизмов
индукции антимикробной активности
VI.3.2. Органная культура жирового тела как перспективный источник белков
медицинского назначения
Выводы
Список употребляемых в работе сокращений
Список литературы
1.3.4. Влияние нейроэндокринной системы на иммунные процессы у Calliphora vicina
Предпосылку для изучения иммуно-нейроэндокршшых взаимодействий у насекомых зачастую создает, прежде всего, онтогенетическая вариабельность иммунного ответа. Так, например, способность иммунокомпетентных клеток выделять антимикробные молекулы в значительной степени зависит от стадии развития, на которой происходит инфицирование. В жизненном цикле насекомого есть периоды, когда иммунный ответ очень слабый и наоборот (Wicker et al., 1990; Samakovlis et al., 1990; Spence et ah, 1992). А поскольку все онтогенетические преобразования находятся под строгим контролем со стороны нейроэндокринной системы, есть основания полагать, что и иммунные процессы подчинены этому правилу.
Начало изучению иммуно-нейроэндокршшых взаимодействий у C.vicina положил Кроссли (Crossley, 1964, 1968). Он обратил внимание на изменение количества фагоцитов в онтогенезе синей мясной мухи. После того, как личинка перестает питаться и начинает готовиться к окукливанию, количество фагоцитов в ее организме резко возрастает. Однако если личинке наложить изолирующую лигатуру (на уровне IV сегмента) в то время, когда она еще не окончила питание, количество фагоцитов в задней части тела останется низким. С другой стороны, досрочное введение личинке р-экдизона провоцирует преждевременное увеличение количества фагоцитов в гемолимфе. Точно так же, инъекция Р-экдизона позади изолирующей лигатуры, восстанавливает нормальное содержание фагоцитов в задней части тела насекомого.
В опытах по изучению влияния нейроэндокринной системы на синтез пептидных антибиотиков у личинки мухи C.vicina наложение изолирующей лигатуры не оказывает влияния на титр антимикробных пептидов, выделяемых иммуноцитами при заражении насекомого бактериями (Черныш и др., 1998). С другой стороны, известно, что состав антимикробных пептидов C.vicina, продуцируемых в ответ на септическое заражение, подвержен качественным и количественным изменениям в онтогенезе (Chernysh et ah, 2000). Результаты сопоставления данных по динамике антимикробных пептидов с данными по изменению титра экдистероидов на протяжении жизненного цикла мухи свидетельствуют о том, что снижение антимикробной активности всегда следует за повышением титра гормона. Этот факт является косвенным доказательством иммуносупрессорных свойств экдистероидов (Chernysh et ah, 1995).
Следует, однако, отметить, что нейроэндокринная система может выступать не только в роли супрессора, но и в роли индуктора защитных реакций. Нейрогенная индукция синтеза