β-пропеллерная фитаза Bacillus ginsengihumi: клонирование гена, очистка белка, свойства фермента

• Автор: Ахметова, Алина Ильдусовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 105 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Фитаты и их распространение
2. Микробные фитазы, классификация и свойства i i
3. Генная инженерия фитаз
4. Биотехнологическое применение фитаз
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Отбор и скрининг почвенных образцов
2. Среды и условия культивирования бактерий
3. Штаммы бактерий и плазмиды
4. Идентификация штамма на основе MIS-анализа
5. Идентификация микроорганизмов на основе анализа 16SpPHK
6. Определение фитазной активности
7. Выделение ДНК из клеток бацилл
8. Выделение плазмидной ДНК
9. Конструирование плазмид с геном фитазы В.

ginsengihumi М2 Л
9Л КлонированиеphyBg в плазмиду pTZ57R/T
9.2 Клонирование phyBg в плазмиду pQLinkH, pQLinkG
9.3 Клонирование phyBg в плазмиду рЕТ-46 Ek/LIC
10. Рестрикционное картирование ДНК
11. Лигирование ДНК
12. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
13. Выделение ДНК из агарозного геля
14. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
15. Электрофорез

16. Иммуноблоттинг
17. Получение рекомбинантного штамма E. coli с геном 39 фитазы В. ginsengihumi М2.
18. Методы очистки и выделения белка
19. Определение локализации фермента
20. Электрофорез в ПААГ
21. Определение белка
22. pH-оптимум и рН-стабильность
23. Температурный оптимум и термостабильность
24. Влияние ионов металлов на активность фермента
25. Субстратная специфичность фермента
26. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)
27. Секвенирование и геноинформатика
28. Тест на стимуляцию роста растений
29. Иммобилизация наноматериалов на поверхности 45 клеток
30. Тест на токсичность, инфильтрация листьев растения
31. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Выделение изолятов фитат-гидролизующих бактерий и
их характеристика
2. Идентификация изолятов
3. Геноинформационный анализ генов фитаз
4. Амплификация гена фитазы, подбор оптимальных 54 условий ПЦР и секвенирование
5. Подбор системы экспрессии и клонирование гена 57 фитазы В. ginsengihumi М2.
6. Получение рекомбинантного штамма E. coli, несущего
ген фитазы В. ginsengihumi М2.

7. Разработка метода очистки фитазы В. ginsengihumi

8. Определение первичной структуры фитазы В. ginsengihumi М2.
9. рН-оптимум и рН-стабильность фитазы
10. Температурный оптимум и термостабильность фитазы
11. Влияние ионов двухвалентнных металлов на активность фитазы
12. Субстратная специфичность фитазы
13. Влияние В. ginsengihumi М2.11 на рост картофеля
14. Влияние магнитных частиц на клетки В. ginsengihumi

15. Определение токсичности В. ginsengihumi М2.11 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

об./мин. Осадок ресуспендировали в 250 мкл раствора I с добавлением РНКазы в концентрации 1 мг/мл. К суспензии добавляли 250 мкл ресуспендирующего раствора II. Эппендорф переворачивали 3-4 раза в течение 3 мин. Добавляли 350 мкл нейтрализирующего раствора III, тщательно перемешивали 4-6 раз. Смесь центрифугировали 5 мин до выпадения в осадок клеток и хромосомной ДНК. Супернатант переносили на GeneJET колонку. Колонку центрифугировали в течение 1 мин при 12 тыс. об./мин. Колонку промывали, добавляя 500 мкл промывающего раствора и центрифугировали в течение 30-60 секунд при 12 тыс.
об./мин. Далее GeneJET колонку переносили в чистый 1.5 мл эппендорф. Добавляли 50 мкл буфера для элюции в центр колонки. Эллюат выдерживали в течение 2 мин при комнатной температуре и центрифугировали 2 мин при 12 тыс.
об./мин. Выделенную плазмидную ДНК хранили при -20°С в буфере для элюции.
9. Конструирование плазмид с геном фитазы В. ginsengihumi М2.
Клонирование гена фитазы проводили в различные векторные системы экспрессии.
9.1 Клонирование phyBg в плазмиду pTZ57R/T
С помощью праймеров к внутренним фланкирующим областям ORF гена фитазы B.subtilis (AN NC000964.3), на матрице ДНК В. ginsengihumi М2.11 синтезировали ПЦР-продукты, содержащие последовательность гена фитазы В. ginsengihumi (phyBg). С помощью кита InsT/Aclone клонировали ген в вектор pTZ57RJT. Лигазной смесью трансформировали штамм E. coli XL1 Blue с добавлением ампициллина. Рекомбинатные штаммы высевали на идентификационную среду с IPTG и X-Gal. Отбирали белые рекомбинантные колонии, выделяли плазмидную ДНК. Проводили ПЦР-анализ рекомбинантных плазмид по сравнению с исходным вектором pTZ57R/T, рестрикционный анализ по сайтам Xbal, Pstl и секвенирование клонированной ДНК.