Действие стрессовых факторов на бактериальные биопленки с дефектом структуры внеклеточного полимерного матрикса

• Автор: Стрелкова, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Особенности структуры и состава биопленок
1.1 Вступление
1.2 Строение биопленок
1.3 Основные этапы формирования биопленок
1.4 Факторы, влияющие на процесс формирования биопленок
1.5 Участие регуляторной системы quorum sensing в биопленко-
образовании
2 Типы и механизмы взаимоотношений микроорганизмов, входящих в
состав биопленок
3 Влияние условий внешней среды и биоцидов на функционирование
биопленок
3.1 Действие антибиотиков
3.1.1 Ингибиторное действие
3.1.2 Стимулирующее действие
3.1.3 Механизмы устойчивости к антибиотикам
3.1.4 Устойчивость к стрессовым факторам
4 Персистентность и адаптивный мутагенез в биопленках
4.1 Понятие о персистентности
4.2 Механизмы персистентности: системы токсин-антитоксин
4.3 Адаптивный мутагенез
5 Использование биопленок в биотехнологии
6 Способы борьбы с формированием биопленок и клеток-персистеров
7 Заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 1 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1 Объекты исследования
1.2 Культивирование и хранение микроорганизмов
1.3 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и
физико-химическим факторам среды
1.4 Микроскопические методы
Глава 2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Чувствительность к антибиотикам
2.2 Динамика формирования биопленок
2.3 Стимуляция антибиотиками формирования биопленок
2.4 Визуализация внеклеточного полимерного матрикса с помощью
микроскопических методов
2.4.1 Световая микроскопия
2.4.2 Электронная микроскопия
2.4.3 Атомно-силовая микроскопия
2.5 Вклад внеклеточного полимерного матрикса в устойчивость биопленок к экстремальным факторам среды
2.5.1 Зависимость от температуры
2.5.2 Зависимость от pH
2.5.3 Влияние концентрации ИаС
Обсуждение результатов
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
Известно, что микробные популяции в биопленках существенно отличаются по физиолого-биохимическим свойствам от суспензионных культур [James et al., 1995]. Реализация специфического биопленочного фенотипа определяет повышенную устойчивость биопленок к стрессовым факторам, антибиотикам и другим биоцидам. Изучению механизмов устойчивости биопленок посвящено большое количество работ. Среди возможных причин повышенной устойчивости к антимикробным препаратам исследователи называют индукцию систем, обуславливающих экскрецию антибиотиков из клеток [Nikaido, 2009], низкую скорость диффузии антибиотиков через внеклеточный полимерный матрикс [Lewis, 2001], возникновение клеток-персистеров [Levin and Rozen 2006], сниженную скорость метаболизма бактерий в биопленках [Costerton et al., 1999]. Описан интересный механизм протокооперативных взаимоотношений в условиях бинарной биопленки: галотолерантный
нефтеокислитель не только выживает, но и размножается при концентрации NaCl, которая является летальной для чистой планктонной культуры этого галотолеранта, за счет накопления в биопленке гапофильным спутником осмопротекторного вещества (эктоина) [Плакунов с соавт., 2008]. В случае устойчивости биопленок к неблагоприятным физико-химическим факторам среды (таким, как pH и температура) некоторые авторы предполагают важную роль матрикса биопленок [Scher et al., 2005]. Однако экспериментальные доказательства механизма этого явления отсутствуют.
Поэтому механизмы устойчивости биопленок к антимикробным веществам и стрессовым факторам среды, а также роль в этих процессах внеклеточного полимерного матрикса заслуживают более детального изучения. Следует отметить, что из-за различий в применяемых методиках и в экспериментальных подходах в процессе получения биопленок, появилось множество разнообразных и, иногда, альтернативных взглядов на механизмы этой
микроорганизмов. Так, одни авторы показали, что субингибиторные концентрации тобрамицина подавляют N-ацетилгомосеринлактон-зависимую систему у штамма PUPa3 P. aeruginosa, приводя к снижению биопленкообразования [Babic et al., 2010]. Однако, по данным других исследователей, тобрамицин в субингибиторных концентрациях усиливает образование бипленок штаммом P. aeruginosa PAOl [Linares et al., 2006]. Хотя для вышеуказанного штамма PAOl P. aeruginosa наблюдалось подавление N-ацетилгомосеринлактоновой кворум-сенсинг системы в присутствии трех других антибиотиков (фторхинолона, цефалоспорина, азитромицина) [Skindersoe et al., 2008].
Субингибиторные концентрации аминогликозидов стимулируют образования биопленок у E.coli. При этом аминогликозиды (тобрамицин) подавляют процесс трансляции, что активирует гидролиз гуанозинтетрафосфата (ppGpp). В свою очередь, снижение уровня ppGpp приводит к дерепрессии образования белка PgaA, участвующего в биосинтезе адгезина (поли-бета- 1,6-М-ацетилглюкозамина). Для максимального образования данного адгезина необходимо активация еще одного белка PgaD, зависящая от вторичного мессенджера - цикло-дигуанозинмонофосфата (c-di-GMP) [Boehm et al.,2009].
Другие исследователи также обнаружили, что индукция биопленкообразования под действием субингибиторных концентраций аминогликозидов у P. aeruginosa происходит с участием цикло-дигуанозинмонофосфата (c-di-GMP). Ген агг (регулятор, зависящий от аминогликозидов) кодирует фосфодиэстеразу, субстратом которой является с-di-GMP. В клетках, мутантных по гену агг, снижается активность данной фосфодиэстеразы, и повышается чувствительность таких клеток к тобрамицину. Показано, что при добавлении гуанозинтрифосфата (GTP), который ингибирует активность данной фосфодиэстеразы, наблюдается подавление образования биопленок [Hoffman et al., 2005].