Разнообразие магнитотактических бактерий пресных водоемов европейской части России

• Автор: Дзюба, Марина Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. РАЗНООБРАЗИЕ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАГНИТОЛАКСИСА
1.1. Магниторецепция у бактерий. Магнитотаксис
1.2. Видовое разнообразие магнитотактических бактерий
1.3. Разнообразие и филогения представителей рода Magnetospirillum
1.4. Гипотезы происхождения и эволюции магнитотактических бактерий
ГЛАВА 2. ФИЗИОЛОГИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ
2.1. Особенности физиологии представителей рола Magnetospirillum
2.2. Особенности физиологии магнитотактических бактерий других таксономических групп
2.3. Стратегии выделения чистых культури культивирования магнитотактических бактерий
ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОМИНЕРАЛИЗАЦИИ МАГНЕТИТА И СИНТЕЗА МАГНЕТОСОМ
3.1. Организация геномов магнитотактических бактерий
3.2. Идентификация магнетосомных генов
3.3. Молекулярная организация генов магнетосомных белков
3.3.1. Характеристика MAI
3.3.2. Организация магнетосомных генов внутри MAI
3.4. Функции отдельных магнетосомных белков
ГЛАВА 4. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ И МАГНЕТОСОМ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1. Объекты исследования
5.2. Получение обогащенных суспензий МТБ
5.3. Методы исследования морфологии и строения клеток
5.5. Молекулярно-биологические методы и филогенетический анализ
5.5.1. Выделение ДНК
5.5.2. Выделение высокомолекулярной ДНК
5.5.3. ПЦР-амплификация
5.5.4. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе
5.5.5. Клонирование ПЦР-фрагмента
5.5.6. Выделение плазмидной ДНК
5.5.7. Секвенирование библиотек клонов
5.5.8. Филогенетический анализ
5.5.9. Фингерпринтинг
5.6. Выделение и культивирование штаммов МТБ
5.6.1. Магнитное обогащение МТБ в капилляре (“race track”)
5.6.2. Среды и условия культивирования
5.6.3. Получение чистых культур
5.6.4. Физиолого-биохимическая характеристика
5.7. Секвенирование и аннотация генома Magnetospirillum aberrantis SpK. Анализ целевых генов
5.7.1. Секвенирование и аннотация генома
5.7.2. Идентификация и анализ генов, ответственных за обмен железа и
биоминерализацию магнетита М. aberrantis
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ
6.1. Морфология клеток МТБ из изучаемых водоемов
6.2. Филогенетическое разнообразие магнитотактических кокков исследуемых водоемовбб
6.2.1. Получение библиотек клонов фрагментов генов 16S рРНК
6.2.2. Филогенетический анализ
ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ИЗУЧАЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ
7.1. Характеристика новых штаммов магнитотактических спирилл SO-1, SP-1 и Sel
7.1.1. Выделение чистых культур и культуральные признаки
7.1.2. Морфологические особенности
7.1.3. Физиолого-биохимическая характеристика
7.1.4. Выявление генов RubisCO и NifH с помощью ПЦР-анализа
7.1.5. Филогенетический анализ
7.1.6. Фингерпринтинг-ПЦР выделенных штаммов
7.2. Magnetospirillum aberrantis sp. str. SpK - пресноводная хемоорганотрофная бактерия, способная к синтезу нерегулярных включений магнетита
7.2.1. Выделение чистой культуры и культуральные признаки
7.2.2. Морфологические особенности
7.2.4. Физиолого-биохимическая характеристика
7.2.5. Филогенетический анализ и таксономическое положение
7.2.6. Таксономическое описание
ГЛАВА 8. СЕКВЕНИРОВАНИЕ И АННОТИРОВАНИЕ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ГЕНОМА MAGNETOSPIRILLUM ABERRANTIS SPK SP
8.1. Общая информация о геноме
8.2. Анализ ОРС, предположительно соответствующих генам метаболизма железа Magnetospmllum aberrantis SpK sp
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

3.2. Идентификация магнетосомных генов.
В связи с ограниченным числом штаммов МТБ, доступных в чистой культуре, исследование генетических основ синтеза магнетосом в основном проводят на двух видах пресноводных магнитотактических спирилл - М. gryphiswaldense и М. magneticum, выбранных в качестве модельных организмов. Такой выбор обусловлен относительной легкостью культивирования (в сравнении с другими МТБ), а также возможностью проводить на этих штаммах основные манипуляции, принятые в генетических исследованиях: селекцию клонов на чашках с агаром, перенос ДНК посредством коньюгации и электропорации, направленный и случайный мутагенез и другие [81, 82, 94]. Идентификацию генов, ответственных за магнитотактический фенотип проводят с использованием трех основных стратегий: с использованием протеомного анализа, обратной генетики с использованием направленного мутагенеза и сравнительного геномного анализа. С помощью протеомного анализа магнетосомной мембраны и направленного мутагенеза у М. gryphiswaldense были идентифицированы 23 гена, кодирующих специфические белки, ассоциированные с мембраной магнетосом [60, 61]. Эти белки были отнесены к различным семействам и названы Мат А, В, С, D, Е, F, G, J, М, N, О, Q, R, S, Т, W, Y и X, MmsF, Mms6, ММ22, MmeA, MtxA, Mmsl6. Все гены, за исключением mmeA, mtxA, mmslô и тМ22, были локализованы в одном участке генома - MAI. В похожем исследовании, проведенном для М. magneticum было обнаружено 78 белков, ассоциированных с мембраной магнетосом. Только 14 из них (Mmsl6, Mms6, MamC, F, E, J, M, A, R, B, D, K, S и О) совпадают с найденными в протеоме магнетосом М. gryphiswaldense [152]. Такое большое количество обнаруженных белков может быть связано с контаминацией препарата магнетосом другими белками клетки, что нередко дает ложные результаты при протеомном анализе. Таким образом, к существенным недостаткам протеомного подхода следует отнести риск получения ложноположительных результатов благодаря контаминации, возможные потери белков, представленных мало на поверхности или в мембране
магнетосом, а также невозможность идентифицировать белки временно