Синтез антибиотического комплекса широкого спектра действия лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K

• Автор: Устюгова, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие свойства молочнокислых бактерий
1.1.1 Характеристика рода Lactococcus
1.2. Низкомолекулярные антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий
1.3.Фунгицидные вещества молочнокислых бактерий
1.4. Бактериоцины молочнокислых бактерий: свойства и классификация
1.4.1. Биосинтез и формирование зрелых молекул лантибиотиков
1.4.2. Механизм действия лантибиотиков
1.4.3. Свойства и биосинтез бактериоцинов II класса
1.4.4. Механизм действия бактериоцинов II класса
1.4.5. Способы определения бактериоцинов
1.5. Применение МКБ и их антимикробных метаболитов в пищевой промышленности и медицине
Заключение по литературному обзору
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
II. 1. Изучение диссоциации и отбор наиболее активного диссоцианта из популяции
штамма Lactococcus laclis subsp. lactis
11.2. Определение антибиотической активности штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
11.3. Определение спектра антимикробного действия активного диссоцината штамма Lactococcus laclis subsp. lactis 194-K
11.4. Выделение и изучение свойств антибиотических веществ, синтезируемых
Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
II.4.1. Условия экстракции антибиотического комплекса из культуральной жидкости штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K и его фракционирование
11.4.2. Очистка гидрофобных антибиотиков 194-Аи 194-В, образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
11.4.3. Очистка антимикробных пептидов, образуемых Lactococcus lactis subsp.
lactis 194-K
11.4.4. Изучение физико-химических и биологических свойств
выделенных антибиотиков

И.5. Изучение влияния ферментационных сред на синтез антибиотического
комплекса лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
II.5.1. Изучение распределения антибиотических веществ между клетками и нативным раствором в зависимости от среды культивирования штамма-продуцента
II.6. Изучение возможности применения штамма Lactococcus lactis subsp. lactis
194-K в качестве пробиотической культуры
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Изучение диссоциации штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и отбор
наиболее активного диссоцианта
111.2. Выделение и идентификация антибиотических веществ, синтезируемых
Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
111.2.1. Экстракция антибиотического комплекса из культуральной жидкости штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K и его фракционирование
111.2.2. Выделение из фракции II гидрофобных антибиотиков 194-А и 194-В, образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K, и изучение
их физико-химических свойств
111.2.3. Выделение и изучение физико-химических свойств антимикробных пептидов (194-D и низина А) из фракции I, синтезируемых
Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
111.3. Влияние ферментационных сред на синтез антибиотического комплекса
и его отдельных компонентов Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
111.3.1. Влияние ферментационных сред на синтез антимикробных
пептидов лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
111.3.2. Влияние ферментационных сред на синтез фунгицидного
антибиотика штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
111.4. Оценка возможности применения штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K
в качестве пробиотической культуры
Заключение
Выводы
Список литературы

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
АДФ - аденозиндифосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота
ОФ-ВЭЖХ - обращено-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ИЭФ - изоэлектрофокусирование
КЖ- культуральная жидкость
ман- ФТС - фосфотрансферазная система маннозы
МКБ - молочнокислые бактерии
С8 - неподвижная фаза н-октилсиликагель
С18 — неподвижная фаза (сорбент) к-октадецилсиликагель
ТСХ - тонкослойная хроматография
ФЕП - фосфоенолпируват
ХВЗК - хронические воспалительные заболевания кожи AcCN - ацетонитрил
lan (ABCEFGHJKMPTQX) - гомологичные гены оперона, вовлеченные в биосинтез лантибиотиков
Lan (АВСРТ) - ферменты, участвующие в биосинтезе лантибиотиков
Nis (ABCKRT) - продукты соответствующих генов оперона биосинтеза низина
TFA - трифторуксусная кислота

Неферментативные методы определения активности более традиционны и требуют больше времени. Они основываются на способности бактериоцинов диффундировать в агар и измерении зоны подавления роста тест-культуры. Но такого рода измерения субъективны и зоны подавления роста тестовой культуры не всегда пропорциональны концентрации антибиотика в среде (Salcido et al., 2007). Но они наиболее популярны среди исследователей. Для увеличения точности и чувствительности метода, основанного на диффузии в агар, предлагается добавлять Твин-80 в среду в концентрации от 0,3 до 1%, а также выдерживать тест-организм при температуре 4 “С в течение ночи. В качестве тест-организмов могут использоваться многие виды бактерий, чувствительные к низину: Lactobacillus sake, Micrococcus luteus, Bacillus stearothermophilus, B.coagulans, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Streptococcus agalactiac (Баранова и др., 1997; Стоянова, Егоров 1999; Pongtharangkul et al., 2004).
Гораздо более точным является иммунологический метод с применением поликлональных антител, позволяющий определять количество низина в диапазоне от 0,7-7,8 нг/мл (Reunanen, Saris, 2007). Использование моноклональных антител, специфшчных к низину А, либо к низину Z, позволяет определять их количество по отдельности (Dadoudi et al., 2001).
Недавно был описан принципиально новый экспресс-метод определения бактериоцинов, основанный на фшуорисценции алкалоида берберина при его внутриклеточной локализации (Salcido et al., 2007). Берберин флуоресцирует, связываясь с различными биомолекулами, включая ДНК и глюкозаминогликаны. Он меньше АТФ и может проникать в клетку через поры или при разрушении цитоплазматической мембраны. Предполагается, что мембранное разрушение, вызванное бактериоцинами, и является причиной внутриклеточной локализации алкалоида, поэтому данный метод применим только для бактериоцинов, которые формируют поры, либо нарушают целостность мембраны. Результаты в этом случае могуг быть получены в течение часа.
В литературе описан метод, основанный на опосредованной NisRK индукции внеклеточным низином (Wahlström, Saris, 1999). Была создана плазмида, в которой гены двухкомпонентной сигнальной системы NisRK экспрессировались конститутивно. В этой плазмиде гены биолюминесценции lux А В из Xenorhabdus luminescens находились под низининдуцируемым nisF промотором. Далее плазмида была вставлена в клетки не продуцирующего низин штамма L. lactis MG 1614. В результате у штамма появлялась способность к биолюминесценции в присутствии внеклеточного низина при добавлении люцеферазы. Этот метод является наиблее чувствительным из всех известных на