Изучение механизмов ограничения активности энхансеров D. melanogaster

• Автор: Давыдова, Анна Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цель и задачи исследования
Научная новизна и практическая ценность работы
Апробация работы
Публикации
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
1. Энхансеры: основные характеристики
1.1. Эпигенетический статус энхансеров
1.2. Энхансеры и некодирующая РНК
1.3. Энхансеры и ТЕГЕ-элементы
1.4. Предсказание энхансеров
2. Энхансеры: механизмы ограничения активности
2.1. Конкуренция промоторов за сигнал энхансера
2.2. Энхансеры и инсуляторы
2.2.1. Структурные модели
2.2.2. Транскрипционные модели
2.2.3. «Нейтрализация» энхансер-блокирующей активности инсуляторов32
ГЛАВА III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Генетические методы

1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе
1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий
1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и white в трансгенных линиях
1.4. Генетические скрещивания
2. Биохимические методы
2.1. Работа с бактериальной линией E.coli DH5a
2.1.1. Среды для культивирования
2.1.2. Приготовление компетентных клеток линии Е. coli DH5a
2.1.3. Трансформация плазмидпой ДНК в бактериии линии E.coli DH5a
2.2. Методы работы с ДНК
2.2.1. Рестрикция ДНК, тупление «липких» концов, дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК
2.2.2. Определение концентрации ДНК
2.2.3. Спиртовое осаждение ДНК
2.2.4. Горизонтальпый электрофорез в агарозном геле
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса из бактериальных клеток линии E.coli DH5a
2.2.6.1. Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК
2.2.6.2. Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК
2.2.6.3. Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC
2.3. Саузерн-блот-анализ
2.4. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.4.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы
2.4.2. ПЦР с колоний E.coli DH5a, несущих плазмиду, с использованием Taq ДНК-полимеразы

2.4.3. ПЦР с использованием Pfu ДНК-полимеразы
2.4.4. ПЦР в реальном времени с использованием Plot-Start Taq-ДНК-полимеразы
2.5. Создание трансгенных конструкций
2.5.1. Конструкции для изучение влияния транскрипции на активность энхансеров генов yellow и white
2.5.2. Конструкции для изучение специфичности взаимодействия инсуляторов с промоторами генов
2.6. Иммунопреципитация хроматина
2.6.1. Иммунопреципитация хроматина на разных стадиях развития дрозофила
2.6.2. " Праймеры, использованные для анализа материала методом ПЦР в реальном времени, полученного при иммуноиреципитации хроматина
ГЛАВА IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Изучение влияния транскрипции на активность энхансеров генов yellow и white
1.1. Некодирующая транскрипция влияет на активность энхансеров гена yellow, расположенных на дальнем расстоянии от промотора
1.2. Некодирующая транскрипция влияет на активность энхансера гена white, расположенного на дальнем расстоянии от промотора
1.3. Некодирующая транскрипция влияет на активность энхансеров генов yellow и white, расположенных на близком расстоянии от промотора гена-мишени
1.4. Терминаторы транскрипции стабилизируют активность энхансеров генов white и yellow в составе трансгенных конструкций
2. Изучение специфичности взаимодействия инсуляторов с промоторами генов

Рис. 9. Зависимость «нейтрализации» инсуляции от ориентации инсуляторов. А. Между энхансером и промотором гена находятся два инсулятора, направленные в разные стороны (направление показано стрелками). Происходит усиление взаимодействия между энхансером и промотором за счет их сближения друг с другом. Б. Между энхансером и промотором гена находятся два инсулятора, направленные в одну сторону (направление показано стрелками). Взаимодействие между энхансером и промотором полностью блокируется. Обозначения: звездочкой обозначен энхансер; черными прямоугольниками с белыми стрелками - инсуляторы; остальные обозначения как на рис. 8.
Таким образом, блокирование энхансера может являться результатом конкуренции за взаимодействия между регуляторными элементами энхансерами, промоторами и инсуляторами.
ГЛАВА ІП. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.Генетические методы
Все скрещивания и генетический анализ линий Drosophila melanogaster проводили при температуре 25°С на стандартной питательной среде: агар, дрожжи, сахар. Скрещивания проводились в стандартных стеклянных пробирках, на одну пробирку брали 2-3 самца и 10-15 самок (Lindsley and Zimm, 1992).