Теоретическое обоснование и практическая реализация биотехнологий специализированных молочных продуктов с использованием L-фенилаланин-аммоний-лиазы

• Автор: Бабич, Ольга Олеговна
• Шифр специальности: 05.18.04, 03.01.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Кемерово
• Количество страниц: 473 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1.1 Особенности строения и свойства Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
1.2 Научные и практические аспекты получения
Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
1.3 Прикладное использование Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
1.4 Обоснование основных направлений исследований, их цель и задачи
ГЛАВА 2 ОРГАНИЗАЦИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Организация выполнения работы
2.2 Объекты исследований
2.3 Используемое оборудование
2.4 Методы проведения исследований
ГЛАВА 3 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НАПРАВЛЕННЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ БЕЛКОВ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ
щ. 3.1 Выбор ферментов для проведения направленного гидролиза
белков молочной сыворотки
3.2 Изучение технологических режимов и условий проведения направленного ферментативного гидролиза белков молочной сыворотки
3.3 Изучение функциональных свойств направленных гидролизатов
белков молочной сыворотки
3.4 Заключение по третьей главе
ГЛАВА 4 СКРИНИНГ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИГМЕНТНЫХ
Ф ДРОЖЖЕЙ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-
ЛИАЗУ, И ИХ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ
4.1 Разработка ПЦР-системы для идентификации гена раї пигментных
дрожжей
4.2 Анализ нуклеотидного состава генара1 у выбранных штаммов дрожжей
4.3 Изучение фенотипических особенностей и биохимических свойств выбранных культур
4.4 Выбор штамма суперпродуцента Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
4.5 Заключение по четвертой главе
ГЛАВА 5 МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ
ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ
Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ
5.1 Подбор компонентов и оптимизация питательной среды для культивирования АигеоЬа$1сИит ри11и1ат У
5.2 Исследование влияния параметров культивирования пигментных дрожжей на качественные показатели продукта биосинтеза
5.3 Разработка технологии выделения и очистки Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
5.4 Заключение по пятой главе
ГЛАВА 6 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ НА НАНОЧАСТИЦЫ
6.1 Сравнительная характеристика химического состава и физических свойств частиц оксида железа Ре-О; и Ре
6.2 Оптимизация концентраций конденсирующих агентов, используемых при иммобилизации Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы на частицы Ре203, функционализированные тиофеновыми и сложноэфирными группами
6.3 Изучение физико-химических свойств нативной и иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
6.4 Технологическая схема получения иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы Ре
6.5 Заключение по шестой главе
ГЛАВА 7 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЛИОФИЛИЗАЦИИ Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ
7.1 Изучение теплофизических характеристик
Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
7.2 Исследование влияния процесса замораживания на активность Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
7тЗ Определение криоскопических температур
Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
7.4 Моделирование процессов кристаллизации влаги при замораживании ферментного препарата Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
7.5 Изучение влияния параметров лиофилизации на ее продолжительность
7.6 Изучение кинетики процесса лиофильной сушки
Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
7.7 Заключение по седьмой главе
ГЛАВА 8 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ
РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
8.1 Способ получения белкового эквивалента продукта, предназначенного... для лечения больных фенилкетонурией
8.2 Способ выделения и очистки фермента
8.3 Способ иммобилизации Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах
8.4 Способ лиофилизации фермента Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы
8.5 Ферментный препарат L-фенилаланин-аммоний лиаза
8.6 Оценка цитотоксичности Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы Aureobasidium pullulans Y863 in vitro
8.7 Заключение по восьмой главе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ДНК, которая кодирует частичный ген pal бобов и его З'-нетранслированную основную последовательность. к-ДНК использовалась для исследования нозерн-блоттингом полной и полисомальной РНК из обработанных клеток бобов, отобранных в разные моменты времени после обработки. Увеличения транскриптов PAL наблюдались после 30-минутной обработки. Максимум достигался через 3-4 часа после обработки, после чего уровень транскриптов PAL быстро снижался. Напротив, в необработанных контрольных клетках не наблюдалось индукции м-РНК PAL. При добавлении 4-тиоуридина к обработанным клеткам и отбора клеток спустя один час обнаруживались значительные количества этого нуклеотида в м-РНК PAL, подтверждая транскрипцию PAL de novo во время индукции [220, 247,248,296, 328, 432,433].
Lawton с сотрудниками ( 1987) расширили эти наблюдения, изучая скорости транскрипции PAL, используя транскрипцию in vitro в ядре, изолированном от обработанных клеток бобов, отобранных в различные моменты времени после обработки. В течение пяти минут после обработки наблюдались двух-трехкратные увеличения скоростей транскрипции гена pal. Максимальные скорости достигались приблизительно после 80-минутной обработки, что совпадало с фазой максимальной активности транслируемой и гибридизованной м-РНК PAL, наблюдаемой Cramer с сотрудниками (1985) и Edwards с сотрудниками (1985), соответственно. Параллельные эксперименты показали, что активация гена pal - это главный фактор в регуляции повышения активности PAL во время индукции, которая совершается во множестве других покрытосеменных растений и была описана Dixon and Harrison (1990). Примеры, в общих чертах подтверждающие эту точку зрения, относятся к транскрипционному контролю в относительно кратковременных случаях, включая отклики на внешние воздействия. Как описывалось ранее, изменения активности PAL происходят не только во время индукции, но и на всех стадиях развития, приводя к экспрессии pal, специфичной для тканей. Gowri с сотрудниками (1991) сравнили уровни транскриптов pal в различных органах клеток люцерны на протяжении одной — девяти недель после прорастания с использованием нозерн-блоттинга с метками к-ДНК pal люцерны. Максимальные уровни транскриптов