Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

• Автор: Смирнова, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 173 с. : ил.

Оглавление
Список использованных сокращений
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Введение
2.2 Строение хантавирусов
2.2.1. N белок
2.2.2. Белок N8
2.2.3. Белок-предшественник ОРС и его производные: гликопротеины Сп и Сс

2.2.4. Формирование пространственной структуры и созревание Оп и вс
2.2.5. Эндоплазматический (внутривирионный) домен СТ гликопротеинов Оп и Ос
2.2.6. РНК-зависимая РНК-полимераза
2.2.7. Проникновение хантавирусов в клетку
2.2.8. Предполагаемая роль интегринов в проникновении хантавирусов в клетку
2.2.9. Взаимодействия между структурными элементами хантавирусов в процессе транскрипции и репликации. Олигомеризация N белка и упаковка РНК
2.2.10. Взаимодействие с РНК и формирование комплекса КЫР
2.2.11. Структура нековалентного комплекса Оп-Ос
2.2.12. Исследования кинетики образования шипикового комплекса
2.2.13. Взаимодействие шипиков с нуклеокапсидом в процессе сборки частиц

2.3. Классификация хантавирусов
2.4. Гуморальный иммунный ответ против хантавирусов
2.4.1. Методы изучения гуморального иммунного ответа: эпитопное
картирование
2.4.3. Ответ против белков внешней оболочки хантавирусов
2.5. Вакцины для специфической профилактики хантавирусной инфекции 44 2.6 Диагностика хантавирусной инфекции
3. Материалы и методы
3.1. Материалы 5
3.1.1 .Биологические материалы 5
3.1.2. Лабораторные реактивы 5
3.1.3. Олигонуклеотиды
3.2. Методы
3.2.1. Выделение плазмидной ДНК из жидкой среды
3.2.2. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli
3.2.3. Трансформация Escherichia coli
3.2.4. Электрофорез в агарозном геле
3.2.5. Ферментация рекомбинантного продуцента
3.2.6. Подготовка проб
3.2.7. Денатурирующий белковый электрофорез в ПААГ
3.2.8. Иммуноблоттинг
3.2.9. Амплификация ДНК методом ПЦР
3.2.10. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
3.2.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
3.2.12. Лигирование
3.2.13. Выделение тотальной вирусной РНК
3.2.14. Обратная транскрипция
3.2.15. Иммуноферментный анализ
3.2.16. Измерение ß-галактозидазной активности
4. Результаты
4.1. Конструирование продуцентов антигенов вируса Добрава с использованием принципа рационального дизайна

4.1.1 Белки, моделирующие Ы- и С-концевые домены белка вс хантавируса Добрава
4.1.2 Антигены, моделирующие шарнирный район на стыке двух С-концевых доменов хантавируса Добрава
4.1.3 Испытания рекомбинантных штаммов-продуцентов на основе созданных конструкций
4.2. Разработка метода оптимизации технологических свойств антигенов с помощью конструирования и скрининга банков делеционных производных
4.2.1 Отработка методики конструирования и скрининга банков делеционных производных на примере неструктурного антигена ПБ5а вируса гепатита С
4.2.2. Создание продуцентов антигенов на основе белка вс вируса Пуумала с использованием метода конструирования и скрининга банков
5. Заключение
6. Выводы
7. Благодарности
8. Список литературы
Приложение

наибольшим структурным консерватизмом среди антигенов хантавнрусов (Plyusnin el al., 1996). Известно также, что продукция N белка в зараженных клетках человека in vivo находится на существенно более высоком уровне по сравнению с другими вирусными белками (Elliott el al,. 2000). Сочетая характеристики, такие как высокая иммуногенность, консерватизм и высокий уровень продукции, рекомбинантный N белок хорошо подходит в качестве диагностического маркера для иммунологических исследований (Gott et al., 1991), (Lundkvist el al 1993), (Kallio-Kokko et al, 1993), (Zoller et al., 1989). Однако использование тест-систем для выявления антител против N белка или самого этого антигена в клинической практике требует учёта высокой перекрестной реактивности N-белков хантавнрусов различных видов (Wang et al., 1993). Эпитопы, участвующие в перекрестной реактивности, картированы преимущественно в пределах N-концевого фрагмента N белка длиной 49 а.о. (Araki el al, 2001; Jenison et al., 1994). Особенностью антител против эпитопов хантавнрусов Старого Света этого типа является длительная персистенция антител по окончании инфекции (Ruo et al., 1991; Lundkvist et al., 1992). На примере вируса Хантаан минорные эпитопы, обладающие видовой специфичностью, были картированы в С-концевой части N белка (205 - 290 а.о.) (Yoshimatsu et al., 1996). С использованием рекомбинантных одноцепочечных антител аналогичные данные были получены и для N белка вируса SNV (Velappan et al, 2007).
2.4.1. Методы изучения гуморального иммунного ответа: эпитопное картирование
Получение моноклональных антител с заданной специфичностью и аффинностью является одной из важнейших задач, как для фундаментальных научных исследований, так и для биотехнологии и медицины. В организме репертуар незрелых В-клсток, каждая из которых продуцирует один вид антител, формируется за счет перераспределения сегментов вариабельных генов антител (V-генов). При встрече с антигеном эти клетки стимулируются к дифференцировке в короткоживущие плазматические клетки, непосредственно продуцирующие антитела, и долгоживущие клетки памяти, присутствующие в лимфатических узлах, селезенке и костном мозге. Далее при повторной иммунизации происходит повышение аффинности антиген-специфичных клонов антител, связанное с дополнительным мутагенезом в V-гепах, а иногда и рекрутированием новых независимых клонов.
Клон, продуцирующий антитело заданной специфичности, можно выделить путем
создания гибридом (слияние В-лимфоцитов с миеломными клетками). Хотя гибридомная
технология достаточно эффективна и широко применяется на практике, она не лишена
ряда недостатков. К ним относятся высокая трудоёмкость получения и культивирования
клонов, их недостаточная стабильность. Однако, основными причинами, заставляющим