Компонентный состав и гидролитическая способность рекомбинантных целлюлазных препаратов на основе гриба Penicillium verruculosum: новые методы оптимизации состава целлюлазного комплекса

• Автор: Проскурина, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Г.ЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩАЯ БИОМАССА
1Л. Лигноцеллюлозные материалы
1.2. Состав целлюлозосодержащей биомассы из различных источников
1.3. Структура клеточной стенки растений
1.4. Целлюлоза
1.5. Предобработка лигноцеллюлозного сырья
ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕЙ БИОМАССЫ
2.1. Гликозил-гидролазы
2.2. Механизм действия О-гликозил-гидролаз
2.3. Общие представления о ферментативной деградации растительной биомассы
2.4. Особенности строения и свойств целлюлолитических ферментов
2.5. Полисахаридмонооксигеназы, особенности классификации
2.6. Механизм окислительного расщепления целлюлозы под действием полисахаридмонооксигеназ
2.7. Эндоглюканаза IV Trichoderma reesei
2.8. Современные представления о механизме биодеградации целлюлозы
ГЛАВА 3. ПРОДУЦЕНТЫ ЦЕЛЛЮЛАЗ И ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
3.1. Промышленные целлюлазные ферментные препараты
3.2. Ферментный комплекс Pénicillium verruculosum
3.3. Реципиентные штаммы Pénicillium verruculosum

3.4. Принципы создания рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum, несущих гетерологичные гены карбогидраз
3.5. Современные подходы к повышению эффективности процесса биодеградации целлюлозосодержащей биомассы
II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
4.1. Ферментные препараты
4.2. Субстраты
4.3. Прочие реактивы
4.4. Хроматографические сорбенты
4.5. Культивирование трансформантов Pénicillium verruculosum
4.6. Хроматографическое фракционирование ферментных препаратов для определения компонентного состава
4.7. Определение концентрации белка
4.8. Определение биохимических характеристик ферментов
4.9. Методы определения активности ферментов
4.10. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков
4.11. Гидролиз целлюлозосодержащей биомассы
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ НЕСКОЛЬКИХ ФЕРМЕНТОВ
5.1. Получение фьюжн-конструкции и трансформация штамма-реципиента
P. verruculosum 537 niaD<_>
5.2. Получение и скрининг ферментных препаратов
5.3. Компонентный состав новых рекомбинантных ферментных препаратов
5.4. Свойства ферментного препарата P.verruculosum РУ-Ф
5.5. Ферментный препарат P.verruculosum РУ-Ф9 как добавка к препарату
P.verruculosum PV-

ГЛАВА 6. ЭНДОГЛКЖАНАЗА IV Т. ree.se і КАК НОВЫЙ КОМПОНЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ГРИБА Р жггисиЫит
6.1. Ферментный препарат на основе штамма Р.уеггисиїояит РУ-ЭГ1У - продуцента эндоглюканазы IV Т.геезеі
6.2. Компонентный состав ферментного препарата Р.errucidosum РУ-ЭГ1У
6.3. Гидролитическая активность ферментного препарата Р erruculosum РУ-ЭГ1У
6.4. Выделение эндоглюканазы IV Т.гееяеі в гомогенном виде и изучение ее влияния на гидролитические свойства целлюлазного препарата Р.уеггисиїозит РУ-
ГЛАВА 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА РжггисиЫит РУ-ГИСТ4-БГЛЗ піаБ0 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОВЫШЕННОЙ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
7.1. Получение новых ферментных преператов на основе штамма-реципиента Р.уеггисиЬэит РУ-Гист4-БГЛЗ піаО^' при трансформации плазмиды, несущей ген гомологичной ЦБГІ ббкДа
7.2. Исследование компонентного состава новых ферментных препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Ржггисиїояит РУ-Гист4-БГЛЗ піаО^полученньїх

при трансформации плазмиды, несущей ген гомологичной ЦБГІ ббкДа
7.3. Получение новых ферментных преператов на основе штамма-реципиента Р.уеггисиїозит РУ-Гист4-БГЛЗ піаО(_) при трансформации плазмид, несущих гены гомологичных ЦБГІ ббкДа и ЭТИ 39кДа
7.4. Исследование компонентного состава новых ферментных препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р.уегтсиїотт РУ-Гист4-БГЛЗ піаО(),

полученных при трансформации плазмид, несущих гены ЦБГІ ббкДа и ЭГП 39кДа..
7.5. Сравнение гидролитической активности новых рекомбинантых препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р.уеггисиїозит РУ-Гист4-БГЛЗ
7.6. Получение новых ферментных препаратов на основе штамма-реципиента Руеггисиїозит РУ-Гист4-БГЛЗ піаО<_) при трансформации плазмидами, несущими гены ЦБГІ ббкДа Ржггисиїозит, ЭГП 39кДа Р.уеггисиїояит и ЭГ1У 35кДа Г.гее^е/.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

В ходе систематических исследований, проводимых в нашей лаборатории, штамм P.verruculosum PV-151 niaD*'1 неоднократно использовался в качестве реципиентного штамма
при получении комплексных ферментных препаратов разнообразного состава для гидролиза

лигноцеллюлозных материалов. Котрансформация штамма PV-151 niaD(_) плазмидой, несущей ген целевого белка, и трансформирующей плазмиды, несущей ген полноценной нитратредуктазы, сопровождалась возвратом трансформантов к прототрофности, что являлось маркером при отборе трансформантов [113-116].
В ходе работ, проводимых в лаборатории ИНБИ РАН на основе штамма PV-151 niaD*'1 были получены штаммы-продуценты ряда гетерологичных и гомологичных белков. На примере ЦБГ T.reesei и БГЛ A.niger было показано, что рекомбинантный белок не отличается от нативного по своим основным свойствам: удельной активности по отношению к соответствующему субстрату, кинетическим параметрам (Km, kçat), оптимуму pH и температуры действия фермента [117].
На основе штамма PV-151 niai)*'-1 в лаборатории ИНБИ РАН с использованием гистоновой системы экспрессии был получен штамм гриба P.verruculosum, обладающий способностью к продукции гетерологичной БГЛ A.niger (РУ-Гист4-БГЛЗ) [117]. На основе штамма РУ-Гист4-БГЛЗ с увеличенным уровнем секреции БГЛ был получен ауксотрофный мутант РУ-Гист4-БГЛЗ niaD* *, который также может выступать в качестве исходного штамма для создания продуцентов различных целевых ферментов.
3.4. Принципы создания рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum, несущих гетерологичные гены карбогидраз
В последнее десятилетие с развитием ДНК технологий и систем переноса генов для микроскопических грибов широкое распространение получил метод генно-инженерного целенаправленного изменения свойств грибных штаммов-продуцентов. Данный метод позволяет клонировать гены интересующих ферментов из одних микроорганизмов в другие (гетерологичная экспрессия), или увеличивать копийность собственных генов ферментов в микроорганизме (гомологичная экспрессия).
Экспрессия гена интересующего фермента может осуществляться под контролем различных, выбранных исследователем, систем промотор-терминатор. Это может быть собственная система, присущая гену целевого белка, или промотор и терминатор другого гена в зависимости от преследуемых целей.
В лаборатории ИНБИ РАН в ряде работ для экспрессии различных генов в штамме PV-151 niaD*-’ использовали промотор и терминатор транскрипции гена ЦБП P.verruculosum (cbhl).